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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-78901
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2010/7890/


Seroepidemiologische Untersuchungen zur Verbreitung Shigatoxin (Stx)2e-bildender Escherichia coli in hessischen Schweinezuchtbeständen

Vallejo Direktor, German Andres


Originalveröffentlichung: (2010) Giessen : Köhler
pdf-Format: Dokument 1.pdf (1.489 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Ödemkrankheit , Epidemiologie
Freie Schlagwörter (Englisch): Edema disease , prevalence
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
ISBN / ISSN: 3-939403-02-9
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.10.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 06.12.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten derzeit in Deutschland zirkulierende EDEC-Stämme auf gemeinsame Virulenzfaktoren untersucht werden, die als mögliche Antigene für Diagnostika bzw. Vakzine eingesetzt werden könnten. Ferner sollte die EDEC-Seroprävalenz in hessischen Zuchtsauenbeständen bestimmt werden.
E. coli-Isolate (n = 1.428) aus den Kotproben erkrankter Schweine wurden mit kulturell-bakteriologischen und molekularbiologischen Methoden auf das Vorhandensein der Gene für Stx2e, Fimbrien (F4, F5, F6, F18 und F41), Intimin, E. coli-Enterotoxine, Alpha-Hämolysin und O-Antigene untersucht. 164 (11,5 %) Isolate wurden als STEC identifiziert, wobei alle Isolate Stx2e kodierten, das für die Ödemkrankheit verantwortlich ist. Von diesen Isolaten besaßen insgesamt 89 (54,3 %) Isolate auch ein (2,4 %), zwei (46,3 %) oder drei (5,5 %) E. coli-Enterotoxingene. Am häufigsten wurde das hitzestabile E. coli-Enterotoxin ST-II (52,4 %) nachgewiesen. 146 (89,0 %) STEC-Stämme waren fedA (F18-Fimbrien) positiv. Kein Isolat besaß eines der anderen untersuchten Fimbriengene (F4, F5, F6 und F41) oder das eae-Gen. Unter Verwendung von acht polyvalenten Testseren konnte bei 139 STEC-Isolaten (85 %) der O-Typ bestimmt werden. Hier traten vor allem die O-Antigene O141 (51,2 %), O139 (19,5 %) und O138 (7,9 %) auf. E. coli-Stämme der O-Gruppen O147 (4,3 %), O149 (1,2 %) und O157 (0,6 %) kamen seltener vor. Alpha-Hämolysin auf Schafblut-Agar zeigten 153 (93,3 %) STEC-Isolate. Insgesamt 124 (75,6 %) STEC-Isolate konnten anhand der Schlüsselmerkmale stx2e und fedA als typische EDEC-Stämme identifiziert werden.
Um EDEC-spezifische Antikörper bei Schweinen messen zu können, wurde ein ELISA (rHis-StxB2e-ELISA) etabliert, in dem die B-Untereinheit von Stx2e als stationäres Fangantigen eingesetzt wurde. Das Antigen wurde auf gentechnischem Wege als rekombinantes, Histidin-markiertes Fusionsprotein hergestellt und affinitätschromatografisch aufgereinigt. In drei verschiedenen Immunisierungsmodellen wurde rHis-StxB2e auch als Impfantigen an Kaninchen (n = 11) und Ferkeln (n = 30) eingesetzt, um es auf seine Immunogenität zu prüfen. In den Versuchen wurden die Parameter Antigenkonzentration und Aufreinigungsgrad sowie Adjuvans (ISA 266, IMS 1313, inkomplettes Freundsches Adjuvans und HL-3) variiert. Jeder Impfling reagierte auf die Verimpfung von rHis-StxB2e mit der Bildung von Immunglobulinen, was sich im rHis-StxB2e-ELISA als hochsignifikante Serokonversion manifestierte. Mit der einzigen Ausnahme eines Kaninchens, waren Stx2e-neutralisierende Antikörper in den Immunseren jedoch nicht nachweisbar.
Zur Bestimmung der Seroprävalenz wurden 94 Schweinezuchtbetriebe in Hessen durch Randomisierung zur Beprobung ausgewählt. Die Anzahl der je Betrieb zu beprobenden Sauen richtete sich nach der Herdengröße. Dabei sollte bei einer angenommenen innerbetrieblichen Seroprävalenz von 5 % mit 95 %-iger Sicherheit wenigstens ein positives Tier erfasst werden. Insgesamt wurden Blutproben von 1.841 Zuchtsauen mit dem rHis-StxB2e-ELISA auf Stx2e-spezifische Antikörper untersucht. Seropositive Zuchtsauen konnten in 93 Betrieben ermittelt werden. In 87,2 % der Betriebe reagierten mindestens 25 % der Zuchtsauen seropositiv, in 53,2 % mindestens 50 % und in 22,3 % sogar mehr als 75 % der Zuchtsauen. Die statistische Prüfung betrieblicher Einflussfaktoren auf die Seroprävalenz ergab, dass der Anteil seropositiver Sauen in Betrieben, die Einstreu im Wartestall verwendeten, geringer war als in Betrieben ohne Einstreu (p < 0,05). Ferner war die Seroprävalenz in Betrieben der drei südwestlich gelegenen Landkreise im Mittel signifikant höher als in den Betrieben der nordöstlichen Kreise der Untersuchungsregion (p < 0,05). Das Absetzalter der Ferkel war negativ mit dem innerbetrieblichen StxB2e-Titer korreliert (p < 0,05). Andere Faktoren wie die Betriebsart (geschlossener versus offener Betrieb), die Herkunft der Sauen (eigene Nachzucht versus Zukauf), die Verwendung von Einstreu im Abferkelstall, die Reinigungsintensität oder die durchschnittliche Anzahl der Geburten pro Sau und Jahr hatten keinen statistisch nachweisbaren Einfluss.
Nach diesen Ergebnissen sind EDEC in deutschen Schweinezuchtbeständen sehr weit verbreitet. Neben dem Hauptvirulenzfaktor Stx2e gibt es keinen Marker, den alle EDEC besitzen und der sich als weiteres stammübergreifendes Zielantigen für Diagnostika bzw. Therapeutika anbieten würde. Das rHis-StxB2e-Molekül erwies sich in Immunisierungsversuchen als immunogen aber nicht protektiv und war als Fangantigen im ELISA sehr gut zur Diagnostik geeignet. Die mit dem rHis-StxB2e-ELISA erfasste EDEC-Seroprävalenz in südhessischen Schweinezuchtbetrieben zeigte, dass innerhalb der Betriebe deutliche Unterschiede im Anteil seropositiver Sauen vorlagen.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of the present study was to investigate circulating EDEC strains in Germany for common virulence factors that could be used as possible antigens for diagnostics and/or vaccines. Furthermore, the seroprevalence of EDEC in pig breeding farms in Hesse (Germany) should be determined.
Fecal Escherichia coli isolates (n = 1.428) from piglets with edema disease were screened by cultural bacteriological and molecular biological methods for the genes of Stx2e, adhesive fimbriae (F4, F5, F6, F18 and F41), intimin, E. coli enterotoxins, Alpha-hemolysin and O antigens. A total of 164 (11.5 %) isolates were identified as shigatoxin-encoding E. coli (STEC), whereby all these isolates encoded for the Stx2e type of shigatoxins which is responsible for the edema disease of pigs. From these isolates, 89 (54.3 %) isolates tested positive for one, (2.4 %), two (46.3 %) or three (5.5 %) enterotoxin genes. The heat-stable E. coli enterotoxin ST-II (52.4 %) was most frequently detected. 146 (89.0 %) STEC isolates proved positive for fedA (F18-fimbria) while no STEC isolate habored a gene for any other tested fimbriae (F4, F5, F6 and F41) or the eae gene. Using eight polyvalent test sera the O-type could be determined in 139 STEC isolates (85 %). Here, O-antigens O141 (51.2 %), O139 (19.5 %) and O138 (7.9 %) occurred most often while E. coli isolates with O-antigens O147 (4.3 %), O149 (1.2 %) and O157 (0.6 %) were less frequent. The majority of STEC isolates (n = 153; 93.3 %) showed an Alpha-hemolysin phenotype on sheep blood agar. On the basis of the key features stx2e and fedA a total of 124 (75.6 %) STEC isolates could be classified as typical EDEC strains.
In order to quantify EDEC specific antibodies in pigs an ELISA (rHis-StxB2e-ELISA) was established. In this assay the B-subunit of Stx2e was used as immobilized test antigen. The antigen was produced as recombinant histidine-tagged fusion protein by genetic engineering and purified from bacterial cultures by affinity chromatography. To test its immunogenicity, the rHis-StxB2e was inoculated into rabbits (n = 11) and piglets (n = 30) in three different models of immunization. In these assays, several parameters were varied, in particular antigen concentration and purification grade as well as adjuvants (ISA 266, IMS 1313, incomplete Freund´s adjuvant and HL-3). Each treated animal reacted to the inoculation of rHis-StxB2e by the production of antibodies which manifested itself as highly significant seroconversion in the rHis-StxB2e-ELISA. With the exception of one rabbit, Stx2e-neutralizing antibodies were not detected in the immune sera of any animal.
To determine the seroprevalence, 94 pig-breeding farms in Hesse were randomly selected for sampling. The number of sows to be tested on each farm depended on the herd size. At an anticipated in-plant seroprevalence of 5 % at least one animal should test positive with 95 % reliability among the animals tested. Thus, a total of 1.841 breeding sows were tested for Stx2e-specific antibodies with the rHis-StxB2e-ELISA. Seropositive breeding sows could be determined in 93 farms. In 87.2 % of the farms at least 25 % the breeding sows reacted seropositive, in 53.2 % at least 50 % and in 22.3 % even more than 75 %. Statistic analysis of operational factors for their putative effect on the in-plant seroprevalence revealed that the earlier piglets were weaned the higher was the mean anti-rHis-StxB2e titer in a farm (p = 0.013). Furthermore, the portion of seropositive sows was lower in farms where straw bedding was used in the dry sow house than in farms with strawless bedding (p < 0.05). Additionally, the seroprevalence was significantly higher in farms of the three south-western districts than in farms of the north-eastern districts of the investigation region (p < 0.05). Other factors like farm type (closed vs. open farms), origin of sows (own offspring vs. additional purchase), use of straw bedding in the farrowing house, cleaning regime as well as average number of births per sow and year had no measurable influence.
According to these results, EDEC is far common in German pig breeding stocks. Beside the major virulence factor Stx2e there is no other marker that is present in all EDEC strains and therefore may be suitable as an EDEC specific target antigen for diagnostics and/or therapeutics. The rHis-StxB2e antigen is immunogenic and highly valuable as a test antigen in the ELISA. However, this antigen does not provoke the production of Stx2e-neutralizing antibodies. The EDEC serum prevalence in pig breeding farms in southern Hesse shows significant differences between the farms as seized with the rHis-StxB2e-ELISA.