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Processing and turn-over of small non-coding RNA OxyS in E. coli & post-transcriptional regulation of RpoS levels by small non-coding RNAs OxyS and DsrA and the Hfq protein in E. coli

Prozessierung und Umsatz der kleinen nicht-kodierenden RNA OxyS in E. coli & post-transkriptionelle Regulation der RpoS Menge durch die kleinen nicht-kodierenden RNAs OxyS und DsrA und dem Hfq Protein in E. coli

Basineni, Sobha Rani


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Mikrobiologie und Molekularbiologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.10.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 30.11.2010
Kurzfassung auf Englisch: rpoS mRNA is one of the first target RNA shown to be regulated by at least 3 small noncoding
RNAs under various stress conditions. Two out of three sRNAs are involved in the
activation of rpoS mRNA translation. By contrast the third sRNA, OxyS has been implicated
in the repression of RpoS synthesis. OxyS RNA is strictly induced under oxidative stress and
reduces the levels of the stationary phase sigma factor RpoS. In order to reveal a possible
impact of processing on growth-dependent regulation, we analyzed the turn-over rates of
OxyS and rpoS mRNA in early exponential and in stationary growth phase in different E. coli
strains. We were not able to assign a major role to any of the individual endo- or
exoribonucleases (RNase E, RNase III, PNPase or RNase II) on OxyS turn-over in
exponential growth phase. However, the simultaneous lack of RNase E, PNPase and RNase II
activity resulted in some stabilization of OxyS in exponential growth phase, indicating the
combined action of both endo- and exoribonucleases on OxyS turn-over. A greater impact of
RNase E on OxyS turn-over was observed in stationary phase and this in turn was dependent
on the presence of the RNA chaperone Hfq and of DsrA sRNAs (activator of rpoS mRNA
translation). Our data also confirm a role of RNase III in rpoS turn-over, however, only in
exponential growth phase. We conclude that OxyS and rpoS mRNA turn-over rates are
influenced by different RNases and additional factors such as Hfq and DsrA and that the
impact of these factors is strongly dependent on growth phase.
Furthermore, we analyzed the influence of OxyS – inhibitor RpoS synthesis and Hfq and
DsrA – activators of RpoS synthesis, while all three regulators co-exist under oxidative
stress. Our data reveal that growth phase has a strong effect on RpoS levels, while no major
influence of oxidative stress generated by H2O2 is observed. The lack of DsrA resulted in a
small decrease of RpoS levels, which is in agreement with the activating effect of this sRNA
on RpoS translation. A lack of Hfq resulted in significantly reduced levels of RpoS, although
the turn-over of RpoS was reduced compared to the parental wild type. DsrA and OxyS
influenced RpoS turn-over in opposite way by yet unknown mechanisms. These findings
illustrate that main control of growth-phase dependent RpoS expression is at level of rpoS
transcription and that growth phase has a stronger impact on RpoS levels than oxidative
stress.
Kurzfassung auf Deutsch: RpoS ist ein bedeutender Sigmafaktor der stationären Wachstumsphase in E. coli. Die rpoS
mRNA ist eine der ersten RNAs für die unter verschiedenen Stressbedingungen eine
Regulation durch mindestens drei small non-coding RNAs gezeigt wurde. Zwei dieser drei
sRNAs sind an der Aktivierung der rpoS mRNA Translation beteiligt. Im Gegensatz dazu
reprimiert die dritte sRNA die RpoS Synthese. Diese OxyS RNA wird unter oxidativem
Stress induziert und reduziert die Menge an RpoS.
Um einen möglichen positiven Einfluss der RNA-Prozessierung auf deren
Wachstumsphasen-abhängige Regulation nachzuweisen, wurden in dieser Arbeit die
Umsatzraten von OxyS und rpoS in der frühen exponentiellen sowie in der stationären
Wachstumsphase in verschiedenen E. coli Stämmen untersucht. Hierbei war es zwar nicht
möglich einer einzelnen Endo- oder Exoribonukleasen (RNase E, RNase III, PNPase oder
RNase II) eine Hauptrolle im OxyS-Umsatz zuzuweisen, das gleichzeitige Fehlen der
Aktivitäten von RNase E, PNPase und RNase II resultierte jedoch in einer Stabilisierung von
OxyS in der exponentiellen Wachstumsphase. Dies lässt auf eine kombinierte Wirkung der
Aktivitäten von Endo- und Exoribonukleasen auf den OxyS-Umsatz schließen. Ein größerer
Einfluss von RNase E auf den OxyS-Umsatz konnte in der stationären Wachstumsphase
nachgewiesen werden, der außerdem von der Anwesenheit des RNA-Chaperons Hfq und von
der DsrA sRNA (Aktivator der rpoS mRNA-Translation) abhängig ist. Des Weiteren konnte
ausschließlich in der exponentiellen Wachstumsphase eine Beteiligung von RNase III am
OxyS-Umsatz nachgewiesen werden. Die OxyS und rpoS mRNA-Umsätze werden demnach
sowohl von verschiedenen RNasen als auch von weiteren Faktoren wie Hfq und DsrA
reguliert. Der Einfluss der einzelnen Faktoren ist wiederum stark von der Wachstumsphase
abhängig.
Da alle drei Regulatoren von RpoS, OxyS, DsrA und Hfq, unter oxidativem Stress existieren
aber sowohl aktivierenden wie inhibierenden Einfluss auf RpoS haben, wurde in dieser
Arbeit ebenfalls deren Synthese untersucht. Oxidativer Stress, hervorgerufen durch H2O2,
zeigte keinen starken Einfluss, wogegen ein starker Effekt der Wachstumsphase auf die
RpoS-Menge beobachtet werden konnte.
Mutationsanalysen zeigten, dass in Abwesenheit von DsrA eine geringe Verminderung der
RpoS-Menge stattfindet, was in Einklang mit dem aktivierenden Effekt dieser sRNA auf die
RpoS-Translation steht. Das Fehlen von Hfq resultierte sowohl in einer signifikant
reduzierten Menge an RpoS als auch in einem reduzierten RpoS-Umsatz im Vergleich zum
entsprechenden Wildtyp. DsrA und OxyS beeinflussen den RpoS-Umsatz in der
entgegengesetzten Richtung durch bisher unbekannte Mechanismen.
Die gezeigten Ergebnisse verdeutlichen, dass die Regulation der Wachstumsphasenabhängigen
Expression von RpoS auf Ebene der rpoS-Transkription stattfindet und sich die
Wachstumsphase stärker auf RpoS auswirkt als oxidativer Stress.