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Wirkung von Transaminaseinhibitoren auf die Tryptophan-abhängige Pigmentbildung von Malassezia furfur

Vöhrs, Inga Susanne Gabriele


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Transaminaseinhibitoren , Tryptophan , Pigmentbildung , Malassezia furfur , Cycloserin
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Zentrum für Dermatologie, Venerologie und Allergologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 01.12.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegende Arbeit untersucht die Wirkung von Transaminaseinhibitoren
auf die Pigmentbildung von Malassezia furfur. Das Phänomen der
Pigmentbildung von Malassezia furfur durch Verstoffwechselung der
Aminosäure Tryptophan, wenn diese als alleinige Stickstoffquelle vorhanden
ist, wurde 1998 erstmalig beschrieben (Mayser 1998). Diese Pigmente können
verschiedene klinische Ausprägungen der Pityriasis versicolor verursachen,
die eine häufige Malassezia assoziierte Erkrankung darstellt.
Als Grundlagen dieser Arbeit dienten die Untersuchungen an dem verwandten
Organismus Ustilago maydis, die gezeigt haben, dass zur Biosynthese dieser
Vielzahl von komplexen Indolderivate aus Tryptophan nur ein einziger
enzymatisch katalysierter Schritt notwendig ist (Zuther et al., 2008). Dieser
Schritt, die Desaminierung von Tryptophan zu Indolpyruvat, wird in Ustilago
maydis von der Tryptophan-Aminotransferase TAM 1 katalysiert. Dies zeigt,
dass die TAM 1 für die tryptophanabhängige Pigmentbildung verantwortlich
ist. Ein ähnliches Enzym wurde auch in Malassezia-Hefen gefunden. Die
Überlegung bei dieser Arbeit war nun, ob durch den Einsatz eines Tryptophan-
Aminotransferase-Inhibitors die Pigmentbildung von Malassezia furfur
unterbunden werden kann.
In einer ersten Untersuchung wurden die verschiedensten Transaminase-
Inhibitoren auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Aktivität der TAM 1 zu
unterdrücken. In einem Agardiffusionstest auf Pigmentinduktionsagar mit
Tryptophan als alleiniger Stickstoffquelle wurden vier Substanzen gefunden,
die die Pigmentbildung vollständig unterdrückten. Diese vier Substanzen sind 100

Aminooxyacetat, Cycloserin, Terizidon (ein Kondensationsprodukt von
Cycloserin) und Homoserin. Bei identischen Testreihen, durchgeführt auf
modifiziertem Dixon Agar (einem Agar mit mehreren Stickstoffquellen), konnte
keine Wachstumshemmung des Pilzes beobachtet werden. Durch diesen
Versuch konnte gezeigt werden, dass die Substanzen nicht antimyzetisch
wirken und den Pilz abtöten, sondern nur spezifisch die TAM 1 hemmen.
In einem Plattenverdünnungstest mit einer linearen Verdünnungsreihe konnte
die Hemmwirkung quantitativ näher umgrenzt werden. Aminooxyacetat erwies
sich in dem gewählten Versuchsansatz als stärkster Hemmstoff, der schon ab
einer Konzentration von etwa 15 mM in chemisch reinem Wasser vollständig
die Pigmentbildung hemmt. Cycloserin und Terizidon erwiesen sich ebenfalls
als sehr gute Hemmstoffe, mit einer Konzentration von 125 mM (Cycloserin)
bzw. 30 mM (Terizidon). Bei Homoserin war festzustellen, dass es sich bei
diesem Stoff vermutlich um einen reversibel kompetitiv wirksamen Hemmstoff
handelt. Das bedeutet, die Hemmung ist nicht stabil, bei einem erneuten
Angebot von Tryptophan kommt es zu einer Pigmentbildung. Aus diesem
Grunde wurden die Versuche mit Homoserin nicht weitergeführt.
In einer off-label Anwendung wurden nach erfolgter Aufklärung, in Absprache
mit der Ethikkommission und schriftlichem Einverständnis, Patienten mit
Pityriasis versicolor mit einer steril-filtrierten, wässrigen, auf pH 7 gepufferten
D-Cycloserinlösung (0,2 M) behandelt. Jeder Patient erhielt 50 ml dieser
Lösung zur zweimal täglichen Anwendung über 5 Tage im Bereich der
Läsionen. Bei den Patienten mit hyperpigmentierter, im Nativpräparat positiver
PV heilten die Veränderungen vollständig innerhalb von 3 - 5 Tagen ab. Bei
den Patienten mit einer PV alba setzte keine Besserung ein.
Die Ergebnisse zeigen deutlich das therapeutische Potenzial einer Hemmung
der TAM 1 zur Therapie und Prophylaxe der PV und geben zudem Einblicke in 101

die mögliche Pathophysiologie dieser häufigen Erkrankung. Zum ersten Mal
konnte damit gezeigt werden, dass topische Transaminaseinhibitoren wie
Cycloserin einen raschen und positiven Effekt auf das klinische
Erscheinungsbild der PV haben können. Denkbar als ein neuer
therapeutischer Ansatz für die Therapie und Prophylaxe der PV wäre die
topische Anwendung des Präparates z. B. in Form eines Shampoos, das
vorbeugend täglich von diesen Patienten anzuwenden ist, um ein Rezidiv zu
verhindern und der Depigmentierung vorzubeugen. Dies eröffnet
möglicherweise einen spezifischeren Ansatz für die Prophylaxe und Therapie
der PV als eine herkömmliche antimykotische Therapie.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of the current study was to investigate the effectiveness of
transaminase inhibitors in preventing pigmentation of Malassezia furfur. For
the first time Mayser 1998, described that Tryptophan metabolized by
Malassezia furfur lead to pigmentation, when present as a sole nitrogen
source (Mayser 1998). These pigments could result in various clinical
expressions of Pityriasis versicolor, which represents a common Malassezia
associated disease.

This study is based on investigations of the phylogenetical closely related
organism Ustilago maydis. Recently Zuther et al. showed that the biosynthetic
pathway leading to complex indol-derived pigment production from tryptophan
is catalyzed by a single enzyme called TAM 1 (Zuther et al., 2008). TAM 1 is a
Tryptophan-aminotransferase, converting tryptophan to Indolpyruvate, thus
playing a key role in tryptophan induced pigmentation. A similar enzyme was
found in Malassezia species. The hypothesis of this study was that by using a
tryptophan-aminotransferase-inhibitor, pigment formation of Malassezia furfur
can be suppressed.

In a first investigation with an agar diffusion method based on pigment-
inducing agar and tryptophan as a sole nitrogen source, four compounds
completely inhibiting pigmentation were discovered: Aminooxyacetate,
Cycloserine, Terizidon (a condensate of Cycloserine) and Homoserine. The
confirmation that the alleged anti pigmentation effect is based on the specific
inhibition of TAM 1 and not on a possible antimycotic activity was performed
with modified Dixon agar. This medium with a broad spectrum of nitrogen 103

sources showed no growth inhibition in the otherwise identically performed
experiment.

A linear agar dilution test helped to quantify the inhibition effect.
Aminooxyacetat was found to be the strongest inhibitor, capable of inhibiting
the pigment formation completely at a concentration of approximately 15 mM
in chemically pure water. Cycloserine and Terizidon also proved to be very
good inhibitors at concentrations of 125 mM (Cycloserine) and 30 mM
(Terizidon). It was however determined that Homoserine serves as a
reversible competitive inhibitor with unstable inhibition, implying that after
additional supply of tryptophan, pigment formation would occur. Based on this
finding, the investigations with Homoserine were discontinued.

In agreement with the local ethical committee and after informed written
consent, an off-label use was performed with patients suffering from PV. PV
was treated with a sterile-filtered, buffered aqueous solution containing D-
Cycloserine (0,2 M). After informed consent each subject received 50 ml of the
solution to be applied to the lesions twice daily for five days. In patients with
proven hyperpigmented PV-lesions, lesions were completely cured after 3-5
days. On the other hand, no effects were evident in patients with PV alba.
The results of the current study point at the therapeutic potential of TAM 1
inhibition for the treatment and prophylaxis of PV and also adds to the
understanding of the possible pathophysiology of this frequent disease.

For the first time, an imposing effect of a topically applied transaminase
inhibitor on the clinical course of Pityriasis versicolor could be demonstrated.
The topical application of transaminase inhibitors could prove itself as a new
therapeutic approach for the treatment and prophylaxis of Pityriasis versicolor
on daily bases e.g. as shampoo, preventing the recurrence and
depigmentation. Our results also underline the importance of the tryptophan-
derived metabolic pathway in the pathogenesis of Pityriasis versicolor. This
could help to develop a new therapeutic approach in the therapy and
prophylaxis of Pityriasis versicolor, based on a completely different and more
specific approach in treatment than the commonly applied antimycotic therapy.