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Development and application of an enzyme immunoassay for the detection of the mycotoxin Fumigaclavine A

Latif, Hadri


Originalveröffentlichung: (2010) Giessen : VVB Laufersweiler
pdf-Format: Dokument 1.pdf (1.817 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institute of Veterinary Food Science
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5547-9
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.10.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 18.11.2010
Kurzfassung auf Englisch: The present study describes the development of specific polyclonal antibodies
against fumigaclavine A (FuA) in rabbits, and the development of a highly sensitive
enzyme immunoassay (EIA) for this mycotoxin. The Mannich condensation
reaction with formaldehyde was used to conjugate FuA to keyhole limpet
hemocyanin (KLH) as the immunogen, and to bovine serum albumine (BSA) for as
the coating antigen. Conjugation of FuA to KLH with formaldehyde proved to be an
effective approach for the preparation of immunogen for anti-FuA antibody
production.
A competitive indirect EIA was optimized using antiserum obtained from one
rabbit. The EIA was very sensitive for FuA, with a 50% inhibition concentration
(IC50) value of 3.3 ng/ml and a detection limit of the standard curve in buffer
solutions of 0.5 ng/ml. The EIA was very specific for FuA with 1.3%, 12.6%, and
0.2% cross-reactivity with FuB, FuC, and FuD, respectively. IsoFuA and several
other lysergic acid derivatives (ergonovine, ergotamine, and alpha-ergocryptine)
were tested but did not cross-react in this assay.
The EIA was applied to the analysis of FuA in silage and in tissue from the
respiratory system of birds with aspergillosis. The detection limit for FuA in silage
was at 10 ng/g, average recoveries from artificially contaminated control samples
were 77.8%. None of 24 analyzed silage samples contained detectable amounts of
FuA. Although the number of samples was limited, the results indicate that there is
not a widespread problem of FuA in silage.
The detection limit of the assay for FuA in tissue from the respiratory system of
birds was at 1.5 ng/g, with average recoveries from artificially contaminated of
92.7%. FuA was found in 66% tissue samples of aspergillosis cases. Cultivation of
fungal growth on respiratory tissue samples of aspergillosis cases on malt extract
agar (MEA) yielded fungal material which was typical for A. fumigatus. When the
mycelium was extracted and assayed by FuA EIA, high amounts of FuA was found
(up to 8 mg/g mycelium). Further analysis of the mycelium extract by HPLC found
FuA, FuC, and other unidentified compounds. Hydrolysis of FuC which have been
isolated from mycelium extract of A. fumigatus gave a new fumigaclavine
derivative. FuD is proposed as the name of this compound.
Different specificity pattern of the FuA EIA and that of a previously developed
ergonovine EIA were studied. In competitive indirect EIA, the anti-FuA antibody did
detect neither ergonovine nor IsoFuA. Conversely, by competitive direct EIA
format, the anti-ergonovine antibody was able to detect both FuA and IsoFuA.
Using these assays in combination with HPLC separation of cheese extracts, a
series of blue-veined cheeses from the German market were analyzed. None of 16
blue-veined cheese samples contained FuA. However, the presence of IsoFuA in
blue-veined cheese samples was detected using the ergonovine EIA.
This is the first description of antibodies against FuA and the first development of
an EIA for FuA. This is also the first report demonstrating that FuA is correlated
with aspergillosis in birds. However, the role of this mycotoxin in this disease
remains to be clarified.

Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegende Arbeit beschreibt die Herstellung spezifischer Antikörper gegen
Fumigaclavin A (FuA) und die Entwicklung eines hochempfindlichen Enzymimmuntests
(EIA) für dieses Mykotoxin. Die Mannich-Kondensation mit
Formaldehyd wurde verwendet, um Fumigaclavin A an keyhole limpet hemocaynin
(KLH) als Immunogen und an bovines Serumalbumin (BSA) als
Beschichtungsantigen zukoppeln. Die Kopplung von FuA an KLH mittels
Formaldehyd erwies sich als effektiver Ansatz zur Herstellung eines Immunogens
zur Gewinnung von Anti-FuA Antikörpern in Kaninchen.
Ein kompetitiver indirekter EIA wurde erstellt und optimiert, unter Verwendung
polykloner Antikörper eines Kaninchens. Der EIA war sehr empfindlich für FuA, mit
einer 50%-Dosis von 3,3 ng/ml und einer Nachweisgrenze von 0,5 ng/ml (in
Pufferlösung). Der EIA war relativ spezifisch für FuA, mit Kreuzreaktionen von
1,3%, 12,6% bzw. 0,2% Kreuzreaktion für FuB, FuC bzw. FuD. IsoFuA und einige
andere getestete Lysergsäurederivate (Ergonovin, Ergotamin, und alpha-
Ergokryptin) wurden ebefalls untersucht, zeigten aber keine Kreuzreaktion in
diesem Testsystem.
Der EIA wurde zur Untersuchung von FuA in Silage und in Gewebsproben
(Repirationstrakt) von Vögeln mit Aspergillose eingesetzt. Die Nachweisgrenze für
FuA in Silage betrug 10 ng/g, die durchschnittlichen Wiederfindungsraten für FuA
in künstlich kontaminierten Kontrollproben lagen bei 77,8%. Keine der 24
untersuchten Proben enthielt nachweisbare Gehalte an FuA. Obwohl nur eine
begrenzte Probenanzahl untersucht wurde, zeigen die Ergebnisse, dass FuA kein
weit verbreitetes Problem in Silage darstellt.
Die Nachweisgrenze für FuA in Gewebsproben des Repirationstrakts von Vögeln
lag bei 1,5 ng/g, mit durchschnittlichen Wiederfindungsraten für FuA in künstlich
kontaminierten Proben von 92,7%. FuA wurde in 66% der Proben von Vögeln mit
Aspergillose nachgewiesen. Bei einer Kultivierung von Pilzisolaten des
Atmungstraktes auf Malzextraktagar (MEA) entwickelte sich ein Mycel, das typisch
für A. fumigatus war. Bei Extraktion des Mycels und Untersuchung im FuA-EIA
wurden große Mengen an FuA (bis zu 8 mg/g Mycel) nachgewiesen. Bei einer
weiteren Untersuchung des Mycelextrakts mittels HPLC wurden FuA, FuC und
andere, nicht identifizierte Komponenten gefunden. Eine Hydrolyse von FuC, das
aus dem Mycelextrakt von A. fumigatus gewonnen wurde, ergab ein neues
Fumigaclavin-Derivat. FuD wird als Name für diese Verbindung vorgeschlagen.
Zur Untersuchung von Blauschimmelkäse auf Clavin-Alkaloide wurden die
unterschiedliche Spezifitäten des FuA-EIA und eines zuvor entwickelten
Ergonovin-EIA ausgenutzt. Im kompetitiven indirekten EIA für FuA waren alle
Proben negativ. Dagegen wurde bei Verwendung eines kompetitiven direkten EIA
unter Verwendung von Anti-Ergonovin-Antikörpern hohe Meßwerte erzielt. Bei
einer Untersuchung mit Hilfe dieser beiden Testsysteme und einer HPLCTrennung
von Käse-Extrakten wurden Blauschimmelkäse des deutschen Marktes
untersucht. Keine der 16 untersuchten Proben enthielt FuA, jedoch wurde die
Anwesenheit von IsoFuA in Blauschimmelkäse nachgewiesen.
Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmals die die Entwicklung von Antikörpern
gegen FuA und eines Enzymimmuntests für dieses Mykotoxin. Auch wird
erstmalig eine Korrelation zwischen FuA-Gehalten in Gewebe des
Repirationstrakts und der Aspergillose von Vögeln beschrieben. Die Rolle dieses
Mykotoxins bei diesem Krankheitsbild bleibt allerdings noch zu klären.