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Herstellung von hypoallergenen Möhren (Daucus carota) und Analyse ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber mikrobiellen Pathogenen

Peters, Susanna Pirita


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Dau c 1 , Möhrenallergie , Lebensmittelallergie , RNA-Interferenz , Hypoallergene Nahrungsmittel
Freie Schlagwörter (Englisch): Dau c 1 , RNA interference , Carrot allergy , Food allergy , Hypoallergenic food
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Phytopathologie und Angewandte Zoologie
Fachgebiet: Agrarwissenschaften, Ökotrophologie und Umweltmanagement fachübergreifend
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 12.07.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 09.09.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Herstellung von hypoallergenen Möhren
(Daucus carota) mittels der RNA Interferenz-Technologie (RNAi) und mit der Analyse der
Anfälligkeit dieser Möhren gegenüber mikrobiellen Phytopathogenen. Der Fokus der Arbeit
lag auf dem Möhrenprotein Dau c 1. Es kommt in zwei Isoformen Dau c 1.01 und Dau c 1.02
vor. Das Dau c 1 ist das Hauptallergen der Möhre und gehört gleichzeitig der Familie der
Pathogenese-assoziierten Proteine 10 (PR10) an. Etwa 98% der Möhrenallergiker reagieren
auf dieses Protein allergisch. Die Hauptursache für diese Möhrenallergie ist eine
Kreuzallergie mit Birkenpollen. Die Funktion des Dau c 1-Proteins für das
Möhrenimmunsystem und die Möhrenentwicklung ist weitgehend unbekannt. In anderen
Pflanzen konnten diverse Funktionen für die PR10-Proteine festgestellt werden, wie z.B.
Ribonuklease- und antigungale Aktivität.
Um die Funktion der Dau c 1-Isoformen untersuchen zu können, wurden beide Isoformen,
Dau c 1.01 und Dau c 1.02, unabhängig voneinander mittels RNAi in der Möhre (Daucus
carota spp. sativus) des Kultivars Rodelika supprimiert. Es konnten zum ersten Mal deutlich
supprimierte hypoallergene Möhren regeneriert werden. Eine im Vergleich zu
Wildtypmöhrenblättern ~10-fache Reduktion der jeweiligen Isoform lag in den Blättern der
RNAi-Pflanzen vor. Die deutliche Reduktion der jeweils unterdrückten Dau c 1-Isoform
wurde auch proteinbiochemisch mit spezifischen Antikörpern in den Dau c 1.01- und Dau c
1.02-supprimierten Möhrenwurzeln festgestellt. Die meisten Pflanzen entwickelten sich wie
Wildtyppflanzen und zeigten keine Phänotypänderungen. Bei zwei unabhängigen Linien
konnte eine Morphologieänderung der Blätter beobachtet werden, die vermutlich
Insertionsartefakte darstellten.
Es konnte in Resistenzanalysen nachgewiesen werden, dass die hypoallergenen Möhren nicht
anfälliger gegenüber den pilzlichen Phytopathogenen Alternaria dauci, Alternaria radicina
und Botrytis cinerea sind. Diese drei Pilze verursachen den größten agronomischen Schaden
an der Möhrenernte. Es findet auch keine Hochregulation der Dau c 1-Isoformen nach
Alternaria radicina-Befall statt. Dies kann damit zusammenhängen, dass diese nekrotrophen
Pilze nicht die Salizylsäure-abhängige (SA) Abwehr der Pflanze aktivieren, die die PR10-
Transkription nachweislich induziert. Die unbeeinträchtigte Besiedlung der RNAi-Pflanzen
legt nahe, dass die Dau c 1-Isoformen nicht an der Abwehr der getesteten Pathogene beteiligt
sind bzw. dass verwandte PR-Proteine in den Dau c 1.01-supprimierten bzw. in den Dau c
1.02-supprimierten Möhren kompensatorisch wirken. Für Letzteres spricht, dass in den
Resistenzanalysen Hinweise auf eine Kompensation durch die Proteine DcPRPlike1 und PR3
vorlagen. Durch eine SA-Behandlung der Blätter konnte nachgewiesen werden, dass die Dau
c 1 Isoformen in den hypoallergenen Möhren durch SA induzierbar waren. Hierbei zeigte sich
eine Hochregulation der jeweils nicht supprimierten Isoform.
An Patienten durchgeführte Skin-prick-Tests mit RNAi-Möhren zeigten, dass es zu
einer reduzierten allergischen Hautreaktion bei Personen kam, die monosensibilisiert
gegenüber einer der beiden Dau c 1-Isoformen waren. In den IgE-Bindungsreaktionen mit
Patientenseren konnte eine deutlich reduzierte IgE-Reaktion mit den Dau c 1.01-
supprimierten Möhrenproteinextrakten gegen das Dau c 1-Protein festgestellt werden. Des
Weiteren konnten in den IgE-Bindungsreaktionen gegen Dau c 1-Isoformen weitere, noch
nicht charakterisierte, hochmolekulare Möhrenproteine festgestellt werden.
Kurzfassung auf Englisch: The main allergenic protein Dau c 1 of carrots (Daucus carota) causes an allergenic
reaction by 98% of people who suffer from carrot allergy. The main reason for this allergy is
a cross-reaction between Dau c 1 and Bet v 1, the main allergen of Birch pollen. Dau c 1 is
not alone a main allergen, it also belongs to the pathogenesis-related protein family 10
(PR10). Two isoforms Dau c 1.01 and Dau c 1.02 of Dau c 1 exist. The function of Dau c 1 in
carrot development and in carrot defence strategies is unknown. In other plants, many
different functions of PR10 were detected, e.g. ribonuclease activity and antifungal activity.
In the work at hand, hypoallergenic carrots were generated for the first time. This was
achieved by the use of the RNA interference technology.
The functions of the two Dau c 1 isoforms in carrots were analysed in these hypoallergenic
carrots in relation to their function in pathogen defence. The isoforms were silenced
separately in carrots of the cultivar Rodelika. For the first time clearly silenced hypoallergenic
carrots were generated. In the leaves a ~10-fold reduction of each isoform was determined.
An evident reduction of each suppressed isoform was also determined protein-biochemically
by the use of the respective specific Dau c 1.01 and Dau c 1.02 antibodies in roots. Most of
the plants developed as wild type carrots and no phenotypical changes were detected. Only in
two independent lines morphological changes of the leaves were noticed. These changes are
presumably artifacts of the insertion.
The analysis of the resistance stage showed that the hypoallergenic carrots are not more
susceptible to the plant pathogen Alternaria dauci, Alternaria radicina and Botrytis cinerea
than wild-type carrots. These tree funguses cause the largest agronomical damages in carrot
crop. No up-regulation of Dau c 1 isoforms was detected after a Alternaria radicina
challenge. This can result from the fact that these necrotrophic funguses do not activate the
salicylic acid-dependant (SA) defense of the plant which verifiably induces the PR10
transcription. The unimpaired colonisation of the RNAi-plants suggests that the Dau c 1
isoforms do either not participate in the defense of the tested pathogens or that related PR
proteins have a compensatory function in the Dau c 1.01 / Dau c 1.02 suppressed carrots. The
latter is more probable as the resistance analyses indicated a compensation by the proteins
DcPRPlike1 and PR3. A SA-treatment of the leaves was able to prove that the Dau c 1
isoforms in the hypoallergenic carrots were inducible by SA. The SA-treatment showed an
up-regulation of the respective non-suppressed isoform.
Skin-prick-tests with RNAi-carrots performed with patients showed a reduced allgenic
skin reaction with patients who were monosensitized against one of the two Dau c 1 isoforms.
A clearly reduced IgE-reaction with the Dau c 1.01-suppressed carrot-protein-extracts against
the Dau c 1-protein were detected in the IgE binding reactions with sera of patients. Further,
not yet characterized, high-molecular carrot proteins were detected in the IgE binding
reactions against Dau c 1 isoforms.