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Influence of peroxisomes on development, maturation and adult functions of the testis

Nenicu, Anca


Originalveröffentlichung: (2010) Giessen : VVB Laufersweiler
pdf-Format: Dokument 1.pdf (13.400 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institute for Anatomy and Cell Biology II
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5617-9
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.08.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 13.09.2010
Kurzfassung auf Englisch: Peroxisomes are ubiquitous cell organelles with heterogeneous enzyme composition and
functions, depending on the metabolic needs of different cell types, tissues and organ systems.
However, until the beginning of the experimental work of this thesis hardly any knowledge was
available on the metabolic functions of these cell organelles in the testis, despite the well-known
severe pathological alterations in this organ in patients suffering from peroxisomal diseases. Male
children with Zellweger syndrome, the most severe form of a peroxisomal biogenesis disorder,
exhibit cryptorchism and patients with X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD), a single enzyme
defect of a peroxisomal ABC transporter for lipids, show an impairment of testicular functions in
80% of the cases.
Therefore, the main goals of this thesis were to characterize the peroxisomal distribution and
enzyme composition in distinct cell types of normal mouse and human testis and to analyse the
molecular consequences of peroxisome deficiency and its influence on male fertility. To get a
complete overview on the peroxisomal compartment and its enzyme composition in the testis in
normal mice and on the alterations in scsPex13 knockout mice, routine histological analyses with
HE-stained material, Oil red O staining on frozen sections, TUNEL, immunofluorescence and
immunohistochemistry with a variety antibodies against peroxisomal and cell marker proteins,
electron microscopy, laser-assisted microdissection (LAMD), isolation of different testicular cell
types and primary cell culture, cell and tissue homogenisation, subcellular fractionation and
organelle isolation, Western blot analysis, lipid extraction, fatty acid and steroid (androgen)
analyses by GC-MS, genomic DNA isolation, PCR genotyping, total RNA isolation, RT-PCR
analyses and RNAi on primary Sertoli cells were used.
The results of this thesis indicate that peroxisomes in distinct cell types of the testis exhibit
specific enzyme composition and serve divers functions already under normal physiological
conditions. Despite older reports from the literature on the exclusive presence of these organelles
in Leydig cells, in this study peroxisomes were identified with new specific markers in all testicular
cell types, including developing germ cells (except for mature spermatozoa). Peroxisomes alter
their matrix protein composition, aggregate in clusters during spermiogenesis in late stages of
elongated spermatids (step 14 to 16) and are transported into the cytoplasmic droplets and
residual bodies, which are subsequently phagocytosed by Sertoli cells. The highest enrichment of
peroxisomal lipid transporters (ABCD1 and ABCD3) as well as of ACOX2, the key regulatory
enzyme of the b-oxidation pathway 2 for side-chain oxidation of cholesterol and medium levels of
catalase were found in Sertoli cells, suggesting peroxisomes as protectors against lipid toxicity
and oxidative stress to prevent germ cell apoptosis. Leydig cells were selectively enriched in
catalase and ABCD2, indicating that peroxisomes are important also in this cell type for the
protection of steroidogenesis against ROS and for lipid homeostasis. Comparative
immunofluorescence analysis revealed that distribution, abundance and enyzme composition of
peroxisomes were conserved between mouse and man.
To study the molecular consequences of peroxisomal dysfunction on male fertility, a Sertoli cellspecific
knockout mouse was generated by AMH-cre-mediated excision of exon 2 of the Pex13
gene, encoding a protein of the docking complex on the peroxisomal membrane involved in
matrix protein import into the organelle. Due to the absence of PEX13 protein and deficient matrix
protein import, all matrix proteins, such as catalase and thiolase, were mislocalized into the
cytoplasm in Sertoli cells. Few peroxisomal membrane ghosts, positive for PEX14 were still
present in this cell type surrounding large lipid droplets. Within 130 days of postnatal
development, the scsPex13KO animals developed a complete Sertoli cell only syndrome. TUNEL
preparations of paraffin sections revealed that germ cell apoptosis occurred between 90 and 130
days of postnatal development. A strong increase of neutral lipids, such as triglycerides and
cholesteryl esters was observed in Sertoli cells of the seminiferous tubules of P130 scsPex13KO
animals. The accumulation of peroxisome-metabolised fatty acids (VLCFA, pristanic and phytanic
acid) in frozen testis samples suggested the deficiency of peroxisomal a- and b-oxidation. Steroid
measurements revealed normal testosterone levels, but a strong accumulation of
dehydroepiandrosterone (DHEA) and a decrease of all other androgen precursors, suggesting a
block of the D5 pathway in these animals. The expression of mRNAs for the FSH- and LHreceptors
was significantly increased and the ones for transcription factors (Sf1, Gata4) and
enzymes for steroidogenesis (Star, Cyp450scc, Cyp450c17, 3b-Hds) were elevated in Sertoli
cells as well as in Leydig cells of scsPex13KO mice. Specific Sertoli cell markers were also
enhanced (Inha, Trf, Sgp2). Strongly proliferated Leydig cells seemed to dramatically upregulate
their peroxisomal compartment and exhibited a strong increase of peroxisomal ABCDtransporters.
Ultrastructural analysis of different subcellular compartments revealed mitochondria
with rearrangement of their cristae and giant whorl-like structures of SER in Leydig cells.
Mitochondria in Sertoli cells were proliferated and exhibited extremely high levels of SOD2.
Strong ROS production and a similar increase in mitochondrial SOD2 were detected in primary
Sertoli cells with a siRNA-mediated knockdown of the Pex13 gene. Peroxisomal dysfunction in
Sertoli cells led to an induction of constitutive and inducible cyclooxygenases (COX1, COX2),
production of pro-inflammatory cytokines (Il1a, Il6, Tnfa, Mif) and local testicular inflammation,
showing infiltration of macrophages in the interstitial space of the testis in scsPex13KO animals.
In conclusion, peroxisomes in Sertoli cells are essential organelles in the testis for male fertility
which (1) regulate lipid homeostasis in the seminiferous tubules, (2) protect spermatogenesis
against oxidative stress due to ROS increase, (3) are involved in androgen precursor synthesis
and keep androgens in balance, and (4) protect against inflammation through the degradation of
bioactive lipid mediators (e.g. arachidonic acid or eicosanoids).
Since peroxisomal enzyme composition is similar between mice and humans, scsPex13 knockout
mice provide an excellent model system to study human infertility due to peroxisomal deficiency.
Future studies on tissue samples from infertile patients are needed to clarify in which extent
peroxisomes are involved in the pathogenesis of idiopathic infertility.
Kurzfassung auf Deutsch: Peroxisomen sind ubiquitäre Zellorganellen, die abhängig von metabolischen Anforderungen in
unterschiedlichen Zelltypen, Geweben und Organsystemen eine heterogene
Enzymzusammensetzung und unterschiedliche Funktionen aufweisen. Über die metabolische
Funktion dieser Organellen im Hoden standen zu Beginn der experimentellen Arbeiten zu dieser
Dissertation jedoch kaum Informationen in der Literatur zur Verfügung, obwohl ausgeprägte
pathologische Veränderungen in diesem Organ bei Patienten mit peroxisomalen Krankheiten
auftreten. So weisen Knaben mit Zellweger-Syndrom, der schwersten Form eines peroxisomalen
Biogenesedefektes, Kryptorchismus auf und Patienten mit X-chromosomaler
Adrenoleukodystrophie (X-ALD), einem Einzelgendefekt eines peroxisomalen ABC-Transporters
für Lipide, zeigen in 80% der Fälle eine Beeinträchtigung der testikulären Funktion.
Deshalb bestanden die Hauptziele dieser Dissertation darin, die Verteilung und
Enzymzusammensetzung der Peroxisomen in verschiedenen Zelltypen des Hodens der Maus
und des Menschen im Vergleich zu charakterisieren sowie die molekulare Pathogenese der
durch Peroxisomendefizienz ausgelösten Veränderungen zu analysieren und deren Einfluss auf
die männliche Fertilität nachzuweisen. Um einen Überblick über das peroxisomale Kompartiment
im Hoden von Wildtyp-Mäusen und über die Veränderungen in Sertolli-Zell-spezifischen Pex13
Knockout-Mäusen (scsPex13KO) zu erhalten, wurden folgende Methoden in dieser Dissertation
etabliert und angewandt: Morphologische Analyse HE-gefärbter histologischer Präparate,
Ölrot O-Färbung von Gefrierschnitten, TUNEL, Immunofluoreszenz und Immunohistochemie mit
unterschiedlichen Antikörpern gegen peroxisomale und zelltypspezifische Markerproteine,
Elektronenmikroskopie, lasergestützte Mikrodissektion, Isolierung und Kultivierung verschiedener
primärer Zellen aus Hodengewebe, Western-Blot-Analysen, Lipidextraktion, Fettsäure- und
Steroidanalysen mittels GC-MS, Isolierung genomischer DNA und PCR-Genotypisierung,
Isolierung von Gesamt-RNA und RT-PCR Expressionsanalysen, RNAi-Knockdown des Pex13
Gens in primären Sertolizellen, ROS-Nachweis an primären Sertoli-Zellen mittels DHEFluoreszenz.
Die Resultate dieser Dissertation zeigen eindeutig, dass Peroxisomen in den spezifischen
Zelltypen des Hodens schon unter physiologischen Bedingungen unterschiedliche
Enzymzusammensetzung besitzen und verschiedene Funktionen erfüllen. Im Gegensatz zu
Literaturangaben über das Vorkommen der Peroxisomen ausschließlich in Leydig-Zellen wird in
der vorliegenden Dissertation die Existenz dieser Zellorganellen in allen Zelltypen des Hodens,
sogar in Keimzellen (mit Ausnahme gereifter Spermien), nachgewiesen. Peroxisomen ändern
ihre Matrixproteinzusammensetzung und „clustern“ (bilden Gruppen) im Verlauf der
Spermiogenese in späten Stadien elongierter Spermatiden (Stadium 14-16); sie werden in
Residualkörper transportiert und durch anschließende Phagozytose in Sertolizellen abgebaut. Die
höchste Anreicherung der peroxisomalen Lipidtransporter ABCD1 und ABCD3 sowie von ACOX-
2, des Schlüsselenzyms des 2. b-Oxidationswegs zur Seitenkettenoxidation von Cholesterin und auch ein relativ hohes Katalasevorkommen wurden in Sertoli-Zellen nachgewiesen. Dies deutet
darauf hin, dass Peroxisomen in Sertoli Zellen vor Lipidtoxizität und oxidativem Stress schützen.
Leydig-Zellen dagegen waren besonders mit Katalase angereichert und enthielten auch hohe
Mengen ABCD2. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass Peroxisomen in diesen Zellen die
Steroidbiosynthese vor den toxischen Wirkungen von ROS schützen und die Lipidhomöostase
regulieren. Vergleichende Immunofluoreszenzanalysen von murinen und humanen Proben
erbrachten, dass sich Verteilung, Menge und Enzymzusammensetzung der Peroxisomen
zwischen den beiden Spezies nicht grundsätzlich unterscheiden.
Um die molekularen Konsequenzen peroxisomaler Dysfunktion auf die männliche Fertilität zu
untersuchen, wurde eine Sertoli-Zell-spezifische Knockout-Maus durch AMH-cre vermittelte
Exzision des Exons 2 des Pex13-Gens hergestellt. Das Pex13-Gen kodiert ein Protein des
Docking-Komplexes der Peroxisomenmembran, das in den Matrixproteinimport eingeschaltet ist.
Durch das Fehlen des PEX13-Proteins (PEX13p) blieben alle peroxisomalen Matrixproteine, wie
z.B. Katalase und Thiolase, im Zytoplasma der Sertoli-Zellen fehllokalisiert. Einige wenige
Pex14p-positive peroxisomale Membranreste („ghosts“) waren um große Lipidtropfen herum
detektierbar. Innerhalb von 130 Tagen in der postnatalen Entwicklung bildeten die scsPex13-
Knockout-Mäuse ein komplettes „Sertoli cell only“-Syndrom aus. In TUNEL-Präparationen von
Paraffinschnitten konnte der Keimzellverlust durch Apoptose innerhalb des Zeitraums zwischen
90 und 130 Tagen in der postnatalen Entwicklung nachgewiesen werden. ScsPex13 Knockout-
Mäuse (P130) wiesen einen starken Anstieg neutraler Fettsäuren und von Cholesterinestern in
Sertoli-Zellen der Tubuli seminiferi auf. Der Nachweis der Akkumulation von
peroxisomenspezifischen Fettsäuren (sehr langkettige Fettsäuren, Pristan- und Phytansäure) in
Gefrierschnitten ließ weiterhin eine Defizienz von peroxisomaler a- und b-Oxidation vermuten,
was durch die Fehllokalisation von ACOX1 und Thiolase erklärt werden konnte. Steroidanalysen
erbrachten normale Testosteronspiegel, jedoch eine starke Erhöhung von
Dehydroepiandrosteron (DHEA) und die Verminderung aller anderen Androgenvorläufer, was
durch eine Blockierung des D5-Stoffwechselweges auf Höhe der peroxisomalen
17b-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (multifunktionelles Protein 2 = MFP2) in diesen Tieren
erklärbar ist. Eine signifikante Erhöhung der mRNA-Expression der FSH- und LH-Rezeptoren
sowie der Transkriptionsfaktoren (Sf1, Gata4) und der Enzyme für die Steroidsynthese (Star,
Cyp450scc, Cyp450c17, 3bHsd) wurde in Sertoli- und in Leydig-Zellen festgestellt. Auch die
mRNAs spezifischer Sertoli-Zell-Marker waren induziert (Inha, Trf, Sgp2). Die stark proliferierten
Leydig-Zellen des Interstitiums wiesen eine Vermehrung des peroxisomalen Kompartiments auf
und zeigten eine starke Erhöhung der Proteinmenge von peroxisomalen ABC-Transportern. Die
ultrastrukturelle Analyse verschiedener subzellulärer Kompartimente in diesen Zellen erbrachte
Mitochondrien mit veränderten Cristae und große schneckennudelartige („whorl-like“) Aggregate
des glatten ERs. Mitochondrien in Sertoli-Zellen wurden vermehrt aufgefunden und enthielten
hohen Mengen vonn SOD2. Eine starke Induktion der ROS-Produktion und eine Erhöhung der
Zusammenfassung
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SOD2 konnten experimentell auch durch siRNA-ausgelösten Knockdown des Pex13-Gens in
primären Sertoli-Zellen ausgelöst werden. Weiterhin führte die peroxisomale Dysfunktion in
Sertoli-Zellen zu einer Induktion der konstitutiven und induzierbaren Formen der
Cyclooxygenasen (COX1, COX2), zu der vermehrten Produktion von proinflammatorischen
Cytokinen (Il1a, Il6, Tnfa, Mif) und einer Hodenentzündung mit Makrophageninfiltration im
Interstitium in scsPex13 Knockout-Mäusen.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Peroxisomen in Sertoli-Zellen essentielle
Zellorganellen zur Erhaltung der männlichen Fertilität darstellen, die 1) die Lipidhomöostase in
Tubuli seminiferi regulieren, 2) die Spermatogenese gegen oxidativen Stress durch Erhöhung von
ROS schützen, 3) in die Androgensynthese eingeschaltet sind und das Androgengleichgewicht
regulieren und 4) vor Entzündungen des Hodens durch den Abbau von bioaktiven
Lipidmediatoren (z.B.: Arachidonsäure und Eicosanoide) schützen.
Da eine ähnliche Enzymzusammensetzung im Hoden der Maus und des Menschen
nachgewiesen werden konnte, stellen die scsPex13 Knockout-Mäuse ein ideales Modellsystem
zum Studium männlicher Infertilität durch peroxisomale Dysfunktion dar. Zukünftige Studien mit
Gewebeproben von infertilen Patienten sind jedoch notwendig, um aufzuklären, welche Rolle der
peroxisomale Stoffwechsel in der Pathogenese von idiopathischer Infertilität beim Mann spielt.