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Methodenoptimierung für den automatisierten "On-Membrane-Digest" nach Western Blot

Wagner, Anne Christine


Originalveröffentlichung: (2010) Giessen : VVB Laufersweiler
pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.769 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Biochemisches Institut
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5544-8
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.07.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 31.08.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Ein wichtiger Bestandteil der Proteomik ist die Identifizierung exprimierter Proteine und die
Analyse der Proteome von Zellen, Organellen und ganzen Organismen. Diese Methoden
werden z.B. bei der Untersuchung von Krankheitserregern oder pathologischen
Veränderungen in der medizinischen Forschung eingesetzt.
Die 2D-Gelelektrophorese mit anschließendem In-Gel-Verdau in Kombination mit der
Massenspektrometrie stellt neben LC-basierenden Methoden eine der bisher besten
Möglichkeiten dar, Proteine zuverlässig zu identifizieren.
In dieser Arbeit wurde eine automatisierte Methode entwickelt, nach der 2DGelelektrophorese
und dem Transfer der Proteine auf NC- bzw. PVDF-Membranen den
proteolytischen Verdau auf der Blot-Membran zu ermöglichen.
Zur Detektion der Proteine auf den Membranen wurden diese mit dem Farbstoff Direct Blue
71 angefärbt. Anschließend konnten die Spots aus den Membranen ausgeschnitten und dem
automatisierten Verdau zugeführt werden. Ein Großteil dieser Arbeit bestand darin, den
automatischen On-Membrane-Verdau hinsichtlich der nachfolgenden
massenspektrometrischen Identifizierung der Proteine durch Peptide-Mass-Fingerprint-
Analysen zu optimieren, indem Parameter wie Verdauzeit, Zusammensetzung der
Extraktionslösung, Zugabe von Octylglycosid zu den Verdaupuffern und Trypsinmenge
variiert wurden.
Diese Methode wurde dann für die Analyse von Proteinen nach vorangegangenem Western
Blot und Immunodetektion per ECL weiterentwickelt. Hier war die Entwicklung einer
effizienten Waschmethode zur Entfernung des Blockierungsreagenzes Roti-Block von
entscheidender Bedeutung.
Nach dem automatischen Verdau wurden die Verdauextrakte nach geeigneter
Matrixpräparation auf einen MS-Probenträger aufgetragen und der MS-Analyse zugeführt. In
diesem Teil der Arbeit wurden die Proteinidentifizierungen mittels dreier verschiedener
Matrices verglichen: HCCA-Matrix nach Jahn, DHB/HCCA-Mischmatrix und DHB/H3PO4-
Matrix. Hierbei stellte sich heraus, daß Matrices unterschiedlich stark auf Kontaminationen
aus dem Western-Blot Prozess reagieren. So stört das Blockierungsreagenz Roti-Block die
Messung mit HCCA-haltigen Matrices erheblich.
Die Entwicklung dieser automatisierten Verdaumethode direkt von Western Blot-Membranen
ermöglicht nun mit minimiertem manuellem Aufwand die Identifizierung von Proteinen aus
komplexen Proteinproben heraus direkt von Western Blot-Membranen nach immunologischer
Detektion und wird zukünftig derartige Analysen deutlich erleichtern.
Kurzfassung auf Englisch: An important part of proteomics is the identification of expressed proteins and the analysis of
proteomes of cells, organelles or whole organisms. These methods are used in medical
research e.g. for the investigation of pathogens or pathologic changes.
The 2D-gel-electrophoresis combined with in-gel digest and mass spectrometry is – apart
from LC-based methods – so far one of the best strategies to identify proteins reliably.
In this thesis, an automated method for the proteolytic digest on the blotting membranes after
2D-gel-electrophoresis and blottingof the proteins onto NC- or PVDF-membranes was
developed.
For the detection of proteins on the membranes, a Direct Blue 71 staining was performed.
Afterwards, spots were picked from the membranes and subjected to the automated digestion.
A major part of this work focused on the optimization of the automated on-membrane-digest
in order to get optimal results in the following mass spectrometric protein identification by
peptide-mass-fingerprint-analysis. Therefore, parameters like digestion time, composition of
the extraction solution, addition of detergents like octylgycoside to the digestion buffer or the
amount of trypsin were varied.
Furthermore, this method adapted for the analysis of proteins after western blotting and
immunodetection via ECL. For this purpose, the development of an efficient washing method
to remove the blocking reagent Roti-Block was the critical point.
After the automated digestion and the extracted peptides were applied onto the MS sample
tray by apropriate matrix preparation and subjected to MS-analysis.
In a further part of the thesis, three different matrices were compared regarding optimal
protein identification: the HCCA-matrix introduced by Jahn, a mixed matrix consisting of
DHB/HCCA und the DHB/H3PO4-matrix.
It was observed that the matrices showed remarkably different sensitivities towards
contaminations of the samples with Roti-Block derived from the blocking process of the
western blot process. The blocking reagent Roti-Block was found to impair the measurement
with HCCA-containing matrices tremendously.
The automated digestion method directly from western blot membranes developed in this
thesis enables now the identification of proteins from complex protein samples directly from
western blot membranes after immunologic detection with a minimal manual intervention and
will, therefore, facilitate such analyses in the future significantly.