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Nachweis der Expression und Funktionalität des ABC-Transporters P-Glycoprotein in der Bovine Caruncular Epithelial Cell Line 1(BCEC-1)

Waterkotte, Berit


Originalveröffentlichung: (2010) Giessen : VVB Laufersweiler
pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.668 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und -Embryologie ; Zentrum für Frauenheilkunde & Geburtshilfe
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5539-4
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.06.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 07.07.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Dem ABC-Transporter P-Glycoprotein (P-gp), dem Protein des mdr1-Gens, werden
in Mensch, Ratte und Maus fetus-protektive Aufgaben zugesprochen. Er dient einer
großen Reihe an sehr unterschiedlichen Substraten als Transportsystem. Darunter
befinden sich auch zahlreiche veterinärmedizinische Arzneimittel. Seine Rolle in
einer Zelllinie boviner Karunkel-Epithel-Zellen (BCEC-1) sollte in dieser Arbeit im
Hinblick auf eine Nutzung als in vitro Modell für plazentaren Transport geprüft
werden.
RT-PCR-Analysen bewiesen das Vorkommen der mRNA nicht nur dieses Proteins,
sondern auch zweier weiterer ABC-Transporter (BCRP und MRP1) in BCEC-1.
Zudem konnten alle drei Vertreter in Karunkel- und Kotyledonen-Gewebe
nachgewiesen werden.
Mit Hilfe immunhistochemischer Untersuchungen wurde P-gp der apikalen
Zellmembran, das heißt der materno-fetalen Kontaktfläche zugeordnet.
Die funktionelle Aktivität des Proteins in der Zelllinie konnte mittels FACS-Analyse
visualisiert werden. Hierzu wurde der Efflux des P-gp-Substrates Rhodamin123 mit
und ohne Einsatz von P-gp-Inhibitoren Verapamil und PSC833 untersucht.
Verschiedene Verapamil-Konzentrationen (200 µM, 50 µM, 12,5 µM, 3,125 µM, 0,78
µM) erzeugten zum Teil unterschiedlich starke Inhibitionen. So wurden im Mittel mit
3,125 µM Verapamil nur noch 55% der Zellen blockiert. Alle höheren
Konzentrationen führten eine nahezu vollständige Inhibition herbei, ebenso wie 8 µM
PSC833. Eine Dosis von 0,78 µM Verapamil hingegen konnte den Efflux nicht
stoppen.
Ein Transport-Assay mit dem radioaktiv-markierten P-gp-Substrat Digoxin im
Transwell-System diente einem weiteren Nachweis der Funktionalität des Proteins.
Die Zellen wurden auf semipermeablen Membranen kultiviert. Die Konfluenz der
Zellschicht wurde mittels TEER-Messung (transepithelial electrical resistance)
überprüft. Zellen mit TEER-Werten über 500 Omega wurden zum Versuch zugelassen und
entweder von apikal oder von basal mit markiertem Substrat (10 nM, 100 nM, 1 µM,
10 µM) beladen. Probenentnahmen aus dem gegenüberliegenden Kompartiment zu
verschiedenen Zeitpunkten (5, 30, 60 und 90 Minuten) detektierten einen stärkeren
Substrat-Flux von basal nach apikal. Der Einsatz von Verapamil (250 µM) für die
Inhibition des Digoxin-Fluxes (100 nM) zeigte eine Nivellierung beider Fluxrichtungen
auf erhöhtem Fluxniveau. Der stärkere Flux von basal nach apikal wird auf den Efflux
durch das apikal lokalisierte P-Glycoprotein zurückgeführt. Für eine erfolgreiche
Inhibition des P-gp vermittelten Digoxin-Fluxes durch Verapamil spricht die
Angleichung der Stärke beider Fluxrichtungen. Die Niveauerhöhung wurde auf eine
in der Literatur berichtete Induktion von P-gp unter Verapamil-Einfluss zurückgeführt.
Die nachweislich karunkuläre Herkunft der bovinen Zelllinie bietet im Vergleich zu
anderen Zellmodellen, wie den in der Humanmedizin genutzten Choriocarcinoma-
Zellinien oder den endometrialen Zellen nicht-trächtiger Rinder, den Vorteil der
Organ- und Funktionsspezifität. Gleichzeitig repräsentiert BCEC-1 aber vor allen
Dingen maternale Zellen des vierten Trächtigkeitsmonats. Rückschlüsse auf andere
Trächtigkeitszeitpunkte sind nicht ohne Weiteres möglich. Desweiteren ist, mit Blick
auf die fetus-protektive Funktion des P-gp, stets das fetale Kompartiment zu
berücksichtigen. BCEC-1 stellt ein Teilstück der im Ablauf des plazentaren
Transportes involvierten Anteile dar.
BCEC-1 kann als bovines Zellmodell für die Ermittlung von buiatrisch genutzten,
Transporter-spezifischen Substraten und deren Beförderung im maternalen
Karunkelepithel herangezogen werden.
Kurzfassung auf Englisch: The ABC-Transporter P-Glycoprotein (P-gp), the mdr1-Gen product, is supposed to
protect the fetus in humans, rats and mice. It serves as transporter for many
divergent substrates, veterinary products among them. In this study, its existence and
functional role within the Bovine Caruncular Epithelial Cell Line (BCEC-1) were
determined regarding its use as in vitro model for placental transport.
The mRNA of P-gp, BCRP and MRP1 could be detected in BCEC-1 and placentomal
tissue using reverse transcriptase PCR.
Immunohistochemical analysis revealed a mainly apical localisation of P-gp in the
cellular membrane of BCEC-1.
Functional activity of the protein was determined by FACS-analysis using P-gp
substrate Rhodamine123. The efflux of this fluorescent substance was analysed in
presence and absence of the two P-gp inhibitors Verapamil and PSC833. Application
of several concentrations of Verapamil (200 µM, 50 µM, 12,5 µM, 3,125 µM, 0,78 µM)
provoked inhibitions partly differing in strenght. 3,125 µM Verapamil could only block
55% of the rhodamine efflux, whereas higher concentrations and PSC833 (8 µM)
revealed almost total inhibition. Dosages of 0,78 µM Verapamil did not stop the efflux
at all.
Radioactive labelled Digoxin, another P-gp substrate, was used to perform a
transportion assay in a transwell-system. BCEC-1 was cultured on semipermeable
membranes until reaching confluence, which was confirmed by TEER-measurements
(transepithelial electrical resistance). Monolayers producing resistance of more than
500 Omega were admitted to the experiment. The substrate (10 nM, 100 nM, 1 µM, 10 µM)
was applied either to the apical or basal side. At several timepoints (5, 30, 60, 90
minutes) samples were taken from the opposed compartment. As a result a stronger
basal to apical flux was observed. Application of Verapamil (250 µM) for the inhibition
of the Digoxin (100nM) transportation detected a levelling of the two fluxes on a
basically higher flux level. The stronger flux from basal to apical was attributed to the
efflux by the apically located P-gp. The levelling of both fluxes was credited to the
successful inhibition of P-gp by Verapamil. The concurrent higher level of digoxin flux
might be attributed to a reported induction of P-gp by Verapamil.
The proven caruncular origin of this bovine cell line offers some advantages. In
contrast to human choriocarcinoma cells or endometrial cells derived from nonpregnant
cows, BCEC-1 is specific for the organ and the functional state of the
placenta. It represents maternal cells involved in gestation of the fourth month which
restricts conclusions to that timepoint. Besides, for propositions about the fetusprotective
function of P-gp one should take the fetal compartment into account.
BCEC-1 represents a part of the transporting systems in the placenta.
BCEC-1 can serve as bovine in vitro model for the investigation of buiatric,
transporter specific substrates and their transportation across the maternal
caruncular epithelium.