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Spezies-spezifischer Nachweis von Chlamydien bei Haustieren mittels Real-Time PCR

Pantchev, Alexandra


Originalveröffentlichung: (2010) Giessen : VVB Laufersweiler
pdf-Format: Dokument 1.pdf (898 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5538-7
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.04.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 06.07.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung von sensitiven und
zuverlässigen Real-Time PCR-Assays zum Nachweis von Chlamydophila
(Cp.) psittaci, Cp. abortus, Cp. pecorum, Cp. felis, Cp. caviae und Chlamydia
(C.) suis. Dabei wurden DNA-Sequenzen der ompA- und 23S-rRNA-Gene für den
differenzierten Erregernachweis herangezogen. Zur Identifizierung der Chlamydien-
Spezies wurde mit Ausnahme von Cp. psittaci jeweils eine klassische TaqManÒ-
Sonde entworfen. Aufgrund der großen Nukleotidsequenz-Homologie zwischen
Cp. psittaci und Cp. abortus wurden zur Identifizierung von Cp. psittaci zwei
TaqManÒMGB-Sonden verwendet. Im Rahmen der Etablierung der Methoden
wurden Tests zur Reproduzierbarkeit, Spezifität und Nachweisgrenze durchgeführt.
Für alle entwickelten Real-Time PCR-Assays wurde eine Nachweisgrenze zwischen
8 bis 80 Chlamydienpartikel und 4 bis 40 Einschlusskörperchen-bildenden Einheiten
(EBE) pro Reaktionsansatz ermittelt. Alle verwendeten Assays erwiesen sich als
reproduzierbar, spezifisch und sensitiv.
Um die tierartliche Häufigkeitsverteilung der verschiedenen tierpathogenen
Chlamydien-Spezies (Cp. psittaci, Cp. abortus, Cp. pecorum, Cp. felis, Cp. caviae
und C. suis) zu analysieren, wurden DNA-Proben von Psittaziden, Tauben und
verschiedenen Säugetierarten, die bereits positiv auf Chlamydiaceae-DNA getestet
worden waren, mit den Spezies-spezifischen Real-Time PCR-Assays
nachuntersucht. Auffallend ist, dass bei Psittaziden und Tauben nicht nur Cp. psittaci
(92 %), sondern auch Cp. abortus (8 %) relativ häufig vorkam. Während bei
Schweinen, Rindern, Schafen und Pferden DNA der Spezies Cp. psittaci,
Cp. abortus, Cp. pecorum oder C. suis einzeln oder in Kombination festgestellt
werden konnten, wurde bei Katzen mit Cp. felis (135/138; 98 %) sowie bei
Meerschweinchen und Kaninchen mit Cp. caviae (12/12 bzw. 4/4; 100 %)
überwiegend die DNA nur einer einzigen Erregerspezies nachgewiesen. DNA dieser
beiden Chlamydophila-Spezies war auch in den Proben von Hunden (Cp. felis 4/5;
80 % und Cp. caviae 1/5; 20 %) zu finden.
Beim Vergleich der mit den Real-Time PCR-Assays und der Microarray-Technik
erzielten Ergebnisse ließ sich bei 4 der 15 untersuchten Proben eine vollständige
Übereinstimmung bei der Speziesidentifizierung von Chlamydien feststellen. In der
Probe einer Katze wurde mit Hilfe der Microarray-Technik zusätzlich DNA von
C. trachomatis nachgewiesen, für die in dieser Arbeit kein entsprechender Real-Time
PCR-Assay entwickelt worden war. Die 11 unterschiedlich bewerteten Proben
enthielten DNA von wenigstens zwei Chlamydienarten, wobei die Microarray-Technik
stets nur diejenige Spezies erkannte, die im Real-Time PCR-Assay den niedrigeren
CT-Wert erzielte, d.h. das stärkere Signal erzeugte.
Im Rahmen eines Ringversuches, an dem 16 deutsche Untersuchungseinrichtungen
in Deutschland teilnahmen, wurden zwei Real-Time-PCR-Assays zum Nachweis von
Chlamydiaceae- bzw. Cp. psittaci-DNA (Assays 1 und 12) auf ihre Eignung für die
veterinärmedizinische Psittakose-/Ornithose-Diagnostik geprüft. Dazu wurden
insgesamt 25 Proben sowie eine Positiv- und eine Negativkontrolle an die
Teilnehmer verschickt und von diesen nach standardisierten Arbeitsprotokollen
untersucht. Beide Assays erwiesen sich als sensitiv und spezifisch und ergaben eine
Nachweisgrenze von 100 EBE je Probe.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass alle gegenwärtig in der
Veterinärmedizin relevanten Chlamydien-Spezies mit Hilfe von Real-Time PCRAssays
sensitiv und Spezies-spezifisch in entsprechend aufgearbeitetem Probenmaterial
nachzuweisen sind. Alle untersuchten Chlamydien-Spezies kommen bei
Tieren in Deutschland vor. Dabei sind sie nicht auf eine einzelne Wirtsspezies
beschränkt, sondern von ihren Hauptwirten offenbar auch auf Individuen anderer
Arten übertragbar. Die Befunde deuten ferner daraufhin, dass Mischinfektionen durch
zwei Chlamydien-Spezies nicht selten sind. Die Anwendung von Real-Time PCRAssays
in der Routinediagnostik kann insbesondere der in der Psittakose-VO
begründeten Forderung nach dem spezifischen Nachweis von Cp. psittaci gerecht
werden.
Kurzfassung auf Englisch: The objective of the present study was to develop and establish sensitive and reliable
real-time PCR assays for the detection of Chlamydophila (Cp.) psittaci Cp. abortus,
Cp. pecorum, Cp. felis, Cp. caviae and C. suis. For this purpose DNA sequences of
ompA- and 23S-rRNA-genes served as targets. Species-specific assays based on
classical TaqManÒ probes were designed for the identification of all these chlamydial
species except Cp. psittaci. For unambiguous identification of Cp. psittaci it was
necessary to design two minor groove-binding (MGB) probes in order to cope with
the high homology between the target sequences of Cp. psittaci and Cp. abortus.
Establishment of real-time PCR assays included tests for determination of
reproducibility, specificity and the detection limits. In these tests assays were able to
detect DNA equivalent to 8 - 80 chlamydial particles or 4 - 40 Inclusion Forming Units
(IFUs), respectively. All assays proved to be reproducible, specific and sensitive.
To analyze the occurrence of chlamydial species (Cp. psittaci, Cp. abortus,
Cp. pecorum, Cp. felis, Cp. caviae and C. suis) DNA samples from psittacine birds
and pigeons, as well as several mammalian species that had been previously tested
positive in a Chlamydiaceae-specific real-time PCR, were retested with the newly
developed species-specific real-time PCR assays. Surprisingly, DNA not only of
Cp. psittaci (92 %), but also of Cp. abortus (8 %) was found in samples from
psittacine birds and pigeons rather frequently. DNA of Cp. psittaci, Cp. abortus,
Cp. pecorum or C. suis, singly or two species in one sample, was detected in pigs,
cattle, sheep and horses. Cp. felis was the predominant species in samples from cats
(135/138; 98 %), whereas in guinea pigs and rabbits only Cp. caviae was detected
(12/12 and 4/4; 100 %). Interestingly, both pathogens were also identified in samples
from dogs (Cp. felis 4/5; 80 % and Cp. caviae 1/5; 20 %).
Fifteen samples were comparatively tested for chlamydial DNA by the newly
developed real-time PCR assays and an established microarray assay. Four samples
yielded the same results in both assays. In one sample from a cat C. trachomatis
was detected additionally, a species not considered in the process of PCR assay
development. Samples yielding different results in both assays contained DNA of at
least two chlamydial species. In each of these eleven samples the microarray assay
detected only one species and in particular that species that gave the strongest
signal in the real-time PCR assays.
A ring trial among 16 german laboratories was performed in order to test the
suitability of two real-time PCR assays (assays 1 and 12) for the detection of
Chlamydiaceae- and Cp. psittaci-DNA, respectively, in veterinary
psittacosis/ornithosis diagnostics. For this purpose a panel of 25 samples as well as
a positive and negative controls were shipped and tested by the participants
according to a standard PCR protocol. Both assays approved to be specific and
sensitiv and revealed a detection limit of 100 IFU per sample.
Results of this study demonstrate that all chlamydial species currently relevant in
veterinary medicine can be detected sensitively and species-specifically in processed
clinical samples by means of real-time PCR assay. All chlamydial species that were
looked for in this study were detected among animals in Germany. Since none of
these species was restricted to a single host species transmission of these
pathogens from their major hosts to individuals of other species appears as a
common phenomenon. Moreover, results suggest that mixed infections by two
chlamydial species occurs frequently. The application of real-time PCR assay in
routine diagnostics meets the requirements of German psittacosis regulation claiming
for species-specific detection of Cp. psittaci.