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Expression and role of serotonergic and nicotinic acetylcholine receptors in alveolar macrophages

Mikulski, Zbigniew


Originalveröffentlichung: (2010) Giessen : VVB Laufersweiler
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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Anatomie und Zellbiologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5533-2
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.04.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 12.07.2010
Kurzfassung auf Englisch: Alveolar macrophages (AM) hold a key position in initiating inflammatory responses in the
lung by secreting TNFalpha and several additional cytokines and chemokines. Their activity is
controlled by paracrine signals such as ATP which might either be actively release as a
signaling molecule or liberated during cell death, thereby reflecting a danger signal. The
present study was aimed to determine to which extend, and via which receptor, serotonin (5-
HT), an amine released from activated platelets, and nicotinic acetylcholine receptors
(nAChR), a receptor class that has been identified in mediating anti-inflammatory effects, also
participate in paracrine modulation of AM function.
The expression of 5-HT type 2 receptors and the effects evoked by stimulation with 5-HT
were investigated in mouse AM. Expression of the 5-HT receptors was analyzed by RT-PCR.
Alveolar macrophages expressed receptor subtypes 5-HT2A, 5-HT2B and 5-HT2C, with the
strongest and most consistent expression being noted for 5-HT2C receptors. In mouse AM, 5-
HT (10-5 M) induced a rise in intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) that was initiated
by release of Ca2+ from intracellular stores and depended on extracellular Ca2+ in a sustained
phase. This 5-HT-induced increase in [Ca2+]i was neither observed in AM treated with the 5-
HT2C receptor-selective inhibitor RS102221 nor in AM derived from 5-HT2C receptordeficient
mice. Alveolar macrophages stimulated with 5-HT (10-5 M) showed increased
production of CCL2, CCL5 and TNFalpha as determined by a dot-blot assay. These data
demonstrate the presence of functional 5-HT2C receptors on AM and suggest a role of 5-HT as
novel modulator of AM function. Importantly, these effects are exclusively driven by the 5-
HT2C receptor, thereby providing the potential for selective intervention.
In addition, the nAChR inventory of freshly isolated rat and mouse AM was determined and
the cellular events evoked by stimulation with nicotine were investigated. Positive RT-PCR
results in rat AM were obtained for nAChR subunits alpha3, alpha5, alpha9, alpha10, beta1, and beta2, with most
stable expression of subunits alpha9, alpha10, beta1, and beta2. Mouse AM expressed nAChR subunits alpha9,
alpha10, beta2 and beta4. Notably, mRNA coding for subunit alpha7, which is proposed to convey the
nicotinic anti-inflammatory response of macrophages from other sources than the lung, was
not detected. RT-PCR data were supported by immunohistochemistry on rat AM isolated by
lavage, as well as in lung tissue sections and by Western blotting. Measurements of [Ca2+]i in
rat and mouse AM did not reveal any changes in response to nicotine. However, nicotine (10-4
M), given 2 min prior to ATP and 5-HT, significantly reduced the agonist-induced rise in
[Ca2+]i. This nicotinic effect was further studied in rat AM, where it was blocked by alpha-

bungarotoxin and did not depend on the presence of extracellular calcium. These data
demonstrate that AM are equipped with modulatory nAChR with properties distinct from
ionotropic nAChR mediating synaptic transmission in the nervous system. Their stimulation
with nicotine dampens ATP-induced Ca2+-release from intracellular stores. Thus, the present
study identifies the first acute receptor-mediated nicotinic effect on AM with antiinflammatory
potential.
Taken together, 5-HT, an amine released from activated platelets, and nAChR, a receptor
class that has been identified in mediating anti-inflammatory effects, participate in paracrine
modulation of AM function. Serotonergic stimulation of 5-HT2C receptors activates AM,
whereas nAChR confer an inhibitory influence upon both serotonergic and purinergic
activation via pathways differing from those known from the nervous system. These data
warrant consideration during pharmacological modulation of cholinergic transmission and 5-
HT metabolism and might offer an opportunity to modify AM function in vivo.
Kurzfassung auf Deutsch: Alveolarmakrophagen (AM) nehmen eine Schlüsselstellung in Entzündungsreaktionen in der
Lunge ein, die sie durch die Sekretion von TNFalpha sowie weiteren Cytokinen und Chemokinen
einleiten. Ihre Aktivität steht unter der Kontrolle parakriner Signale, beispielsweise ATP,
welches entweder aktiv sezerniert wird, oder bei Zelltod freigesetzt wird und dann ein
Gefahrensignal darstellt. Die vorliegende Studie hatte das Ziel festzustellen, in welchem
Ausmaß und über welchen Rezeptor Serotonin (5-HT) - ein biogenes Amin, das von
aktivierten Thrombozyten freigesetzt wird - und nikotinische Azetylcholinrezeptoren
(nAChR) - eine Rezeptorklasse, die anti-inflammatorische Mechanismen vermitteln kann –
ebenfalls an der parakrinen Modulation von AM beteiligt sind.
Die Expression von 5-HT-Rezeptoren des Typs 2 und die Auswirkungen einer serotonergen
Stimulation wurden an AM der Maus untersucht. RT-PCR zeigte die Expression der
Rezeptorsubtypen 5-HT2A, 5-HT2B sowie 5-HT2C, wobei der 5-HT2C-Subtyp bei weitem am
stärksten exprimiert war. In AM der Maus bewirkte 5-HT (10-5 M) einen Anstieg der
intrazellulären Kalziumkonzentration ([Ca2+]i), der durch eine Freisetzung aus intrazellulären
Speichern initiiert wurde und in seiner Aufrechterhaltung von extrazellulärem Kalzium
abhängig war. Dieser 5-HT-bedingte [Ca2+]i-Anstieg war nach Gabe des 5-HT2CRezeptorantagonisten
RS102221 und in AM von 5-HT2C-Rezeptor-gendefizienten Mäuse
nicht zu beobachten. Ein Dot-Blot-Assay zeigte eine vermehrte Produktion von CCL2, CCL5
und TNFalpha durch AM nach Stimulation mit 5-HT (10-5 M). Diese Daten zeigen das
Vorkommen funktioneller 5-HT2C-Rezeptoren auf AM und implizieren, dass 5-HT ein neu
identifizierter Modulator der AM-Funktion ist. Da der serotonerge Effekt ausschließlich über
den 5-HT2C-Rezeptor vermittelt wird, ergibt sich das Potenzial einer selektiven Intervention.
Weiterführend wurden das Inventar an nAChR von frisch isolierten AM der Maus und Ratte
und die durch Nikotin hervorgerufenen zellulären Effekte untersucht. In der Ratte ergaben
sich positive RT-PCR-Befunde für die nAChR-Untereinheiten alpha3, alpha5, alpha9, alpha10, beta1 und beta2,
mit konstanter Expression der Untereinheiten alpha9, alpha10, beta1 und beta2. Maus-AM zeigten
Expression der nAChR-Untereinheiten alph9, alph10, beta1 und beta4. Es ist hervorzuheben, dass
mRNA der alph7-Untereinheit, welche für die anti-inflammatorische Wirkung von Nikotin auf
Makrophagen anderer Organe als der Lunge verantwortlich gemacht wird, nicht nachweisbar
war. Die RT-PCR-Befunde wurden durch Immunhistochemie an lavagierten Ratten-AM und
Gewebeschnitten der Lunge sowie durch Western blot gestützt. Weder Maus- noch Ratten-
AM reagierten auf Nikotin mit einer direkten Änderung der [Ca2+]i, aber sowohl der 5-HT- als

auch der ATP-induzierte [Ca2+]i-Anstieg wurde durch eine vorherige (2 min) Gabe von
Nikotin (10-4 M) signifikant abgeschwächt. Dieser Nikotineffekt wurde in der Ratte weiter
analysiert. Er war unabhängig von extrazellulärem Kalzium und ließ sich durch alpha-
Bungarotoxin hemmen. Diese Befunde zeigen, dass AM mit modulierend wirkenden nAChR
ausgestattet sind, deren Eigenschaften sich von den ionotropen nAChR des Nervensystems
unterschieden, die dort die cholinerge synaptische Übertragung vermitteln. In AM dämpft ihre
Stimulation die ATP-induzierte Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern. Die
vorliegende Arbeit identifiziert somit den ersten akuten rezeptorvermittelten nikotinischen
Effekt auf AM.
Zusammenfassend sind sowohl 5-HT - ein biogenes Amin, das von aktivierten Thrombozyten
freigesetzt wird – als auch nAChR - eine Rezeptorklasse, die anti-inflammatorische
Mechanismen vermitteln kann – an der parakrinen Modulation von AM beteiligt. Serotonin
stimuliert AM über 5-HT2C-Rezeptoren, während nAChR über Signalwege, die sich von
denen aus dem Nervensystem bekannten unterscheiden, einen inhibitorischen Einfluss auf
serotonerge und purinerge AM-Aktivierung ausübt. Diese Daten sollten bei der
pharmakologischen Modulation cholinerger Transmission und des 5-HT-Metabolismus
berücksichtigt werden und könnten zugleich eine Möglichkeit der Modulation der AMAktivität
in vivo bieten.