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Transgenic expression of antimicrobial peptides from insects as a tool for analysis of compatibility between plants and pathogens

xx

Khalifa, Walaa Said Mohamed Shaaban


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Freie Schlagwörter (Englisch): antimicrobial peptides , transgenic plants , insects , plant pathogens
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Phytopathologie und Angewandte Zoologie
Fachgebiet: Agrarwissenschaften, Ökotrophologie und Umweltmanagement fachübergreifend
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.05.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 18.05.2010
Kurzfassung auf Englisch: Genetic engineering has proven to be a powerful tool for controlling plant diseases and to
be an alternative to economically costly and environmentally undesirable chemical control.
One promising approach to achieve enhanced disease-resistance has been through the
expression of genes encoding antimicrobial peptides (AMPs) in transgenic plants. Hence,
this study aimed to investigate the feasibility of using the novel insect AMP EtDef, a
defensin from drone fly Eristalis tenax and the well-known AMP thanatin from spined
soldier bug Podisus maculiventris to engineer disease resistance in the model plant
Arabidopsis.
A prerequisite for the utilization of these peptides is a precise knowledge about their
biological activity. Thus, in vitro antifungal activity of the chemically synthesized EtDef
and thanatin was evaluated against the devastating phytopathogens F. culmorum, B.
cinerea and P. parasitica using spore germination inhibition assays. Results of these assays
revealed that synthetic EtDef led to total inhibition of spore germination and mycelial
growth of all tested fungi, with minimum inhibitory concentrations (MICs) varying
between 1 – 2 for B. cinerea and 5 – 10 µM for F. culmorum and P. parasitica. Synthetic
thanatin showed higher efficacy as compared to EtDef regarding inhibitory effects. There
the MICs ranged between 0.5 – 1 µM for B. cinerea, 5 – 10 µM for F. culmorum, and 2 – 5
µM for P. parasitica.
Concomitantly, a protocol for the production of recombinant EtDef in E. coli expression
system was established by inserting the sequence for mature EtDef peptide in frame
downstream of the multiple tag TrxA - His -S of pET32a(+) vector. The resulting
recombinant THS-EtDef protein was then refolded and its in vitro biological activity was
evaluated against B. cinerea using spore germination inhibition assay. It was observed that
THS-EtDef showed also a similar antifungal activity to the chemically synthesized
counterpart, with IC50 occurred at 0.5 µM. This indicates that the presence of the tag,
which is bigger than the AMP peptide, didn´t much alter the activity of EtDef in vitro.
Because of their promising antimicrobial properties, EtDef (with its putative signal
peptide) and the chimeric thanatin (containing HvChi26 signal peptide) were introduced
into Arabidopsis via Agrobacterium-mediated transformation and expressed under the
control of the constitutive CaMV35S promoter. Molecular characterization analysis
revealed that both EtDef and thanatin genes were efficiently transcribed into mRNA,
although the levels of expression varied among transformants.
Due to the signal peptides both AMPs are thought to enter the secretory pathway. Therefor
intercellular washing fluids (IWFs) from individual transgenic plants expressing either
EtDef or thanatin were isolated. Spore germination of B. cinerea was inhibited to various
degrees, indicating that the expression of these peptides was functional and localized to
extracellular space in all transgenic lines tested.
The degree of resistance achieved by expressing either EtDef or thanatin were then
evaluated in planta against the fungal pathogens G. orontii and B. cinerea and the bacterial
pathogen P. syringae pv. tomato strain DC3000. EtDef and thanatin transgenic Arabidopsis
plants displayed remarkably reduced conidial sporulation, hyphal spread and proliferation
of G. orontii on the rosette leaves, mediating enhanced disease resistance in these plants.
This suppressive effect against G. orontii was correlated with RNA expression level. Three
independent EtDef transgenic lines namely 395, 396, and 405 and thanatin transgenic lines
407, 410, and 411 showed high RNA expression levels, and correspondingly high
resistance degree to G. orontii. In contrast, transgenic expression of EtDef and thanatin in
Arabidopsis was clearly less active against B. cinerea. Nevertheless, two EtDef transgenic
lines 396 and 405 and two thanatin transgenic lines 410 and 411 were consistently more
resistant against B. cinerea. When challenged with Pst, all transgenic EtDef lines were as
sensitive as the control plants, except for transgenic line 405. Transgenic expression of
thanatin in Arabidopsis could provide, however, a higher degree of resistance against Pst.
Thanatin transgenic lines 407, 410, and 411, showed the highest resistance to Pst. In
summary, plants of the EtDef transgenic lines 395, 396, 398 and 405 and those of Thanatin
407, 410 and 411 seem to be promising candidates to evaluate their potential in planta
against other phytopathogens. Finally, data presented here indicate that transgenic
expression of EtDef and Thanatin could be utilized to improve disease resistance of other
economically important crops.
Kurzfassung auf Deutsch: Gentechnische Methoden haben sich als wichtiges Werkzeug zur Kontrolle von
Pflanzenkrankheiten erwiesen und bilden eine Alternative zum kostenintensiven und
ökologisch unerwünschten Einsatz von Chemikalien. Als viel versprechender Ansatz zur
Steigerung der Resistenz gegen Krankheiten hat sich die Expression von Genen in
transgenen Pflanzen erwiesen, die für antimikrobielle Peptide (AMPs) kodieren. Ziel der
hier vorgestellten Studie war es daher zu untersuchen, inwieweit sich EtDef, ein neues
Peptid aus der Schwebfliege Eristalis tenax, und das gut untersuchte AMP Thanatin aus
der Raubwanze Podisus maculiventris zur Erhöhung der Krankheitsresistenz der
Modellpflanze Arabidopsis thaliana nutzen lassen.
Voraussetzung für den Einsatz dieser Peptide ist ein präzises Wissen um deren biologische
Wirkung. Aus diesem Grund wurde zu Beginn in Sporenkeimungstests die antimykotische
Wirkung von synthetisch hergestelltem EtDef und Thanatin auf die phytopathogenen Pilze
F. culmorum, B. cinerea und P. parasitica untersucht. Synthetisches EtDef führte hierbei
zu einer vollständigen Inhibierung der Sporenkeimung und des Myzelwachstums bei allen
getesteten Pilzen mit miminimalen Hemm-Konzentrationen (MHK) von 1 – 2 µM für B.
cinerea und 5 – 10 µM für F. culmorum und P. parasitica. Für synthetisches Thanatin
wurde eine größere inhibitorische Wirksamkeit als für EtDef beobachtet. Die minimalen
Konzentrationen zur vollständigen Hemmung lagen hier bei 0,5 – 1 µM für B. cinerea, 5 –
10 µM für F. culmorum und 2 – 5 µM für P. parasitica.
Parallel zu diesen Experimenten wurde ein Protokoll zur Produktion von rekombinantem
EtDef in E. coli etabliert. Hierzu wurde die Sequenz des EtDef Peptids in frame abwärts
des TrxA - His – S Tags des pET32a(+) Vektors inseriert. Die biologische Aktivität des
hergestellten THS-EtDef Proteins wurde in vitro überprüft, wofür wiederum die
Inhibierung der Sporenkeimung bei B. cinerea untersucht wurde. Es konnte eine ähnliche
antimykotische Wirkung für THS-EtDef wie bei synthetischem EtDef gezeigt werden. Das
deutet darauf hin, dass die Aktivität von THS-EtDef in vitro nur gering durch den Tag, der
größer als das AMP selbst ist, beeinflusst wird.
Aufgrund der viel versprechenden antimikrobiellen Eigenschaften wurden mittels
Agrobacterium-vermittelter Transformation Arabidopsis-Pflanzen erstellt, die EtDef (mit
seinem putativen Signalpeptid) oder chimäres Thanatin (mit dem pflanzlichen Signalpeptid
HvChi26) unter Kontrolle des konstitutiven CaMV35S Promotors exprimieren.
Molekularbiologische Tests zeigten, dass sowohl das EtDef-, als auch das Thanatingen
effizient in mRNA transkribiert wurden, wobei zwischen einzelnen Transformanten
variierende Expressionslevel nachgewiesen wurden.
Die vorgeschalteten Signalpeptide sollten zur Sekretion der AMPs in den Apoplasten
führen. Deshalb wurden von individuellen transgenen Pflanzen, die entweder EtDef oder
Thanatin exprimierten intercellular washing fluids (IWFs) isoliert. Die Sporenkeimung von
B. cinerea wurde im Vergleich zur Kontrolle bei den verschiedenen Linien in
unterschiedlichem Ausmaß inhibiert. Das deutet darauf hin, dass die Peptide in allen
untersuchten Linien funktionell und im extrazellulären Raum lokalisiert waren.
Im Folgenden wurde der Grad der Resistenz, der durch die Expression von entweder EtDef
oder Thanatin hervorgerufen wurde, in planta untersucht. Hierfür wurden die pilzlichen
Pathogene G. orontii und B. cinerea und das bakterielle Pathogen P. syringae pv. tomato
DC3000 (Pst) verwendet. Transgene Arabidopsis Pflanzen mit entweder EtDef oder
Thanatin zeigten eine deutlich verringerte Sporulation der Konidien, verringertes
Myzelwachstum und Vermehrung von G. orontii auf Rosettenblättern, was zu einer
erhöhten Resistenz der Pflanzen gegen diesen Pilz führte. Der Effekt auf G. orontii
korrelierte mit der Transcriptmenge in den Pflanzen. Drei unabhängige transgene EtDef-
(395, 396 und 405) und drei Thanatin-Linien (407, 410 und 411) wiesen hohe RNAExpressionslevel
auf, was mit einem hohen Grad an Resistenz gegen G. orontii einherging.
Im Gegensatz dazu zeigte die Expression von EtDef und Thanatin in Arabidopsis eine
deutlich geringere Wirkung auf B. cinerea. Gleichwohl zeigten zwei transgene EtDef- (396
und405) und zwei transgene Thanatin-Linien (410 und 411) eine gesteigerte Resistenz
gegen diesen Pilz. In den EtDef-Linien konnte eine erhöhte Resistenz gegenüber Pst nur in
Linie 405 beobachtet werden. Die Sensitivität der übrigen Linien gegenüber dem
Bakterium war nicht signifikant unterschiedlich zu den Kontrollpflanzen. Jedoch
vermittelte die transgene Expression von Thanatin eine deutlich erhöhte Resistenz der
Pflanzen gegen Pst. Hier zeigten wiederum die transgenen Linien 407, 410 und 411 die
stärkste Wirkung. Zusammengefasst erscheinen die Linien 395, 396, 398 und 405 und 407,
410 und 411 am besten geeignet, um in weiteren Untersuchungen das Potential von EtDef
bzw. Thanatin gegen andere Phytopathogene in planta zu testen. Die in dieser Studie
präsentierten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die transgene Expression von EtDef und
Thanatin genutzt werden könnte, um eine gesteigerte Resistenz gegenüber Krankheiten
auch in anderen, ökonomisch wichtigen, Pflanzen zu erzielen.