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Biochemische und molekularbiologische Effekte einer suboptimalen Manganversorgung bei der wachsenden Ratte

Biochemical and molecular genetic effects of suboptimal dietary manganese in growing rats

Brandl, Klaus


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Ernährungsphysiologie , Manganmangel , Genexpression , Microarray , wachsende Ratte
Freie Schlagwörter (Englisch): nutrition physiology , manganese deficiency , gene expression , microarray , growing rat
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Tierernährung und Ernährungsphysiologie
Fachgebiet: Agrarwissenschaften und Umweltmanagement
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.03.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 18.05.2010
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurden die Effekte einer suboptimalen alimentären Manganversorgung auf die Genexpression und weitere biochemische Parameter anhand eines 6wöchigen Stoffwechselversuchs (0,35 vs. 18,84 mg Mn / kg Diät) mit wachsenden Ratten untersucht. Die Auswirkungen auf zootechnische Parameter, Blutparameter, Gewebsmangankonzentrationen und auf die manganabhängigen Enzyme MnSOD und Arginase wurden ermittelt. Da die Genexpression z.B. der MnSOD auch durch redoxsensitive Transkriptionsfaktoren beeinflusst wird, wurden zudem der totale antioxidative Status (TAOS), die Thiobarbitursäure reaktiven Substanzen (TBA-RS) und das Metallothionein (MT) in den Lebern analysiert.
Zur Genexpressionsanalyse (GEA) mittels drei unterschiedlicher cDNA-Microarray-Paare mit jeweils 1176 Genen wurden Leber-RNA-Probenpools von je drei Mangel- bzw. Kontrolltieren eingesetzt. Aufgrund von Qualitätsmängeln (nicht auswertbare Genspots, nur geringe Übereinstimmungen bei vorhandenen Parallelen beeinflusster Gene und ein stark positives Signal auf einer Negativkontrolle) wurde die GEA mit einem der drei Arraypaare wiederholt, wobei RNA-Pools anderer Tiere eingesetzt werden mussten.
Bezüglich der Lebendmasseentwicklung waren keine signifikanten Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen zu erkennen, die Futteraufnahme war nur gering beeinflusst. Sowohl Hämatokrit als auch Blutglucose wiesen keine signifikanten Gruppendifferenzen auf. Der Hämoglobingehalt war in der Mn-Mangelgruppe ernied¬rigt, aber noch nicht im anämischen Bereich. Die Mn-Konzentrationen in Leber, Femur und Blutplasma waren in der Mn-Mangelgruppe höchstsignifikant und die Aktivität der Leber-MnSOD signifi¬kant reduziert. Die Quantifizierung der Leberarginase ergab keine Gruppenunterschiede. Weder beim TAOS, noch bei den TBA-RS zeigten sich Gruppendifferenzen, wobei die TBA-RS-Werte nicht auf Lipidschädigungen hinwiesen. Für das Gesamt-MT wurde eine signifikant höhere Konzentration in den Lebern der Mn-Mangelgruppe festgestellt.
Die erste GEA zeigte in der Mn-Mangelgruppe bei 11 Genen eine vermin¬derte und bei 17 Genen eine erhöhte Expression. In der Wiederholung der GEA wurden in der Mn-Mangelgruppe 3 Gene mit verminderter und 4 Gene mit erhöhter Expression nachgewiesen. Bei auf den Arrays enthaltenen Genen Mn-abhängiger Enzyme (Arginase I und II, MnSOD, PEPCK, Pyruvatcarboxylase, Glutaminsynthetase, Leber-Catalase, Glycosyltransferasen) konnten in bei¬den Untersuchungen keine Expressionsunterschiede festgestellt werden. In beiden Untersuchungen konnte bei den Proben der Mangeltiere eine deutlich erhöhte Expression des MT1-Gens festgestellt werden. Alle anderen Gene, bei welchen eine Beeinflussung gefunden wurde, konnten im Vergleich beider Untersuchungen nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse der Microarrayuntersuchung für die MnSOD und das MT-1 wurden durch Verifizierung mittels RT-PCR bzw. Northern blot bestätigt.
Daraus wurden folgende Schlussfolgerungen gezogen: Der Einfluss der suboptimalen alimentären Manganversorgung auf die Genexpression wurde wahrscheinlich auch durch andere, teilweise gruppeninterne Faktoren überlagert. Die cDNA-Microarrayanalyse kann, wie sie hier angewendet wurde, aufgrund der zu geringen Sensitivität nur als Screeningmethode betrachtet werden. Für statistisch abgesicherte Aussagen bei höherer Sensitivität wären mehr Wiederholungen je Probe und Array nötig. Eine Verifizierung der Genexpressionsdaten und der Effekte auf die Zielproteine mittels anderer Methoden war geboten. Sowohl die MnSOD als auch die Arginase scheinen einem rein posttranskriptionalen Einfluss des Mangans zu unterliegen. Die Genexpression und damit auch die Konzentration des MT war in der Mangelgruppe wahrscheinlich infolge eines vermehrten Auftretens von ROS erhöht. Bis zu dem hier erreichten Stadium eines Manganmangels konnte die geringere MnSOD-Aktivität in der Mangelgruppe bezüglich der ROS-Entgiftung vermutlich durch erhöhte MT-Level kompensiert werden.
Kurzfassung auf Englisch: In this study the effects of suboptimal alimentary manganese on gene expression and other biochemical parameters should be examined by a metabolism experiment (0.35 vs. 18.84 mg Mn / kg diet) with growing rats over a six-week period. The effects on feed intake, live weight gain, blood parameters, manganese concentration in tissues, and the manganese dependent enzymes MnSOD and arginase were determined. The gene expression of MnSOD depends amongst others on redox sensitive transcriptional factors, thus the total antioxidative status (TAOS), the thiobarbituric acid reactive substances (TBA-RS), and metallothionein (MT) in the liver were examined.
Differential gene expression was analysed in the liver with pooled mRNA from three control and three deficiency animals using three different cDNA-microarray pairs containing 1176 genes on every array. Due to the unsatisfactory quality (non evaluable gene spots, different behavior of parallel occurring affected genes, and a strong signal on negative control) a rerun of the assay was carried out with only one of the array pairs, in which samples from other animals were used.
Live weight gain did not show significant differences between the groups, feed intake was just slightly affected. Neither hematocrit nor blood glucose concentration showed significant differences between the experimental groups. Hemoglobin was significantly lower in Mn deficiency group, however the values did not reach in anemic range. The Mn concentrations in liver, femur and blood plasma were significantly lower (p < 0.001) in the Mn deficiency group. The MnSOD activity in liver homogenates showed significantly lower activities in the Mn deficiency group. The quantification of liver arginase showed no significant differences between the groups. Neither the TAOS nor the TBA-RS showed any differences between the groups, whereby the values of TBA-RS did not indicate any lipid damage. Total MT concentration in the rat liver was significantly increased in Mn deficiency.
With first microarray investigation the expression of 11 genes was diminished and the expression of 17 genes was increased in the Mn deficiency group. With the rerun the expression of 3 genes were diminished and the expression of 4 genes were increased in Mn deficiency. Both analyses did not show any effects on the genes of Mn dependent enzymes investigated (arginase I and II, MnSOD, PEPCK, pyruvate carboxylase, glutamine synthetase, liver catalase, and glycosyl transferases). In both investigations considerably increased expressions of the MT1 gene in Mn deficiency were determined. All further affected genes could not be confirmed by comparison of the investigations. The results of the microarray analysis in relation to MnSOD and MT1 gene expression were confirmed by verification using northern blot and RT-PCR.
These results led to the following conclusions: The effect of suboptimal alimentary manganese on gene expression probably interfered with other effects, also within the groups.