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Einfluss der leberspezifischen microRNA-122 auf die Regulation der Translation der Hepatitis C Virus-RNA

Influence of the liver-specific microRNA-122 on translation regulation of the hepatitis C virus RNA

Henke, Jura Inga


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Biochemisches Institut
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 03.05.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 05.05.2010
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Vorgänge bei der Stimulation der Translation der Hepatitis C Virus-RNA durch die leberspezifische microRNA-122 untersucht.
Das Hepatitis C Virus (HCV) wurde im Jahr 1989 als Erreger der NonA-NonB-Hepatitis identifiziert. Weltweit sind etwa 3 % der Bevölkerung mit HCV infiziert, und 80 % der Infizierten sind nicht in der Lage, das Virus zu eliminieren. Sie entwickeln eine chronische Hepatitis, die langfristig zu Leberschäden wie einer Leberzirrhose oder sogar einem hepatozellulären Karzinom führen kann. Da bis zum jetzigen Zeitpunkt keine schützende Vakzine entwickelt werden konnte und auch die therapeutischen Möglichkeiten noch immer limitiert sind, ist die detaillierte Aufklärung des HCV-Infektionszyklus absolut notwendig.
In den letzten Jahren wurde die positive Regulation des HCV-Replikationszylus durch die leberspezifische microRNA (miR)-122 beschrieben. In unserer Arbeitsgruppe konnte dabei erstmalig gezeigt werden, dass die durch eine interne Ribosomen-Eintrittstelle (IRES)-vermittelte Translation der HCV-RNA durch die miR-122 stimuliert wird. microRNAs sind nicht codierende, kleine RNA-Moleküle, die die eukaryotische Genexpression post-transkriptionell und Gewebe- und Differenzierungsstadien-spezifisch regulieren. Nach ihrer Prozessierung aus längeren Vorläufermolekülen durch nukleäre und cytosolische Enzyme interagieren microRNAs mit komplementären Sequenzen ihrer Ziel-mRNAs und vermitteln in Abhängigkeit vom Ausmaß der Basenpaarungen deren nukleolytische Degradation oder die Inhibition ihrer Translation.
Die untranslatierten Regionen (UTRs) des HCV-Genoms weisen drei zu der miR-122 komplementäre Sequenzen auf; zwei in der 5´-UTR stromaufwärts der HCV-IRES, eine dritte in der 3´-UTR. In der vorliegenden Arbeit konnte die Stimulation der HCV-Translation durch direkte Interaktion der miR-122 mit ihren beiden Zielsequenzen in der HCV-5´-UTR gezeigt werden. Die miR-122 stimuliert die HCV-Translation durch beschleunigte und dadurch vermehrte Bildung von 48S-Translations-Initiationskomplexen mit der HCV-RNA. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass die HCV-RNA und die miR-122 gemeinsam in die 48S-Komplexe inkorporiert sind. Die durch die miR-122 verstärkte Assoziation der HCV-RNA mit Ribosomen zu späteren Zeitpunkten der Initiations-Phase wurde sowohl in Zell-freiem Extrakt als auch in lebenden HeLa-Zellen bestätigt.
Die Aktivierung des HCV durch Interaktion der miR-122 mit Sequenzen in der HCV-5´-UTR ist eines der wenigen Beispiele, in dem die Bindung einer microRNA an die 5´-UTR einer RNA zur Stimulation anstatt zur Repression der Tanslation ihrer Ziel-RNA führt. Auch wenn der molekulare Mechanismus noch nicht bekannt ist, gibt es Hinweise, dass die Modulation der microRNA-Funktion durch die Re-Organisation eines microRNA-Effektorkomplexes vermittelt wird. Bei der Suche nach Faktoren, die diesen stimulierenden Effekt der miR-122 auf die Translation der HCV-RNA übertragen, konnte ein Protein von etwa 68 kDa detektiert werden, um dessen Bindung die miR-122 mit der HCV-RNA kompetiert. Dieses Protein wurde als Heat Shock Cognate 71 kDa Protein (Hsc70) identifiziert.
In Ergänzung zu den Ergebnissen anderer Studien deuten die Beobachtungen dieser Arbeit darauf hin, dass die miR-122 einen wesentlichen Beitrag zum Gewebetropismus des HCV leistet und somit einen Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten bietet.
Kurzfassung auf Englisch: In this study, the molecular mechanisms of the stimulation of hepatitis C virus RNA translation by the liver-specific microRNA-122 were investigated.
The hepatitis C virus (HCV) was discovered in 1989 as the main causative agent of the nonA-nonB-hepatitis. HCV infects an estimated 3 % of the world’s population. About 80 % of infected individuals are not able to eliminate the virus. They develop a chronic hepatitis with a high risk for a long-term progress of liver diseases like liver cirrhosis or hepatocellular carcinoma. Since a protective vaccine is not available yet and the therapeutic options are still limited, the detailed understanding of the viral life cycle is absolutely essential.
During the last years a positive regulation of the HCV life cycle by the liver-specific microRNA (miR)-122 was discovered. However, the stimulation of the internal ribosome entry site (IRES)-mediated translation of the HCV RNA by miR-122 was initially demonstrated in our lab. microRNAs are a family of non-coding, small RNAs that regulate eukaryotic gene expression in a post-transcriptionally and a tissue- and differentiation status-specific manner. Following their maturation from longer precursor molecules by nuclear and cytoplasmic enzymes, microRNAs base-pair with complementary sequences in their target mRNAs and mediate their nucleolytic degradation or the inhibition of their translation, depending of the degree of complementarity.
The untranslated regions (UTRs) of the HCV genome contain three potential target sites for miR-122. Two of them are located in the 5´-UTR upstream of the HCV IRES, the third resides in the 3´-UTR. This study demonstrates the stimulation of HCV translation via direct interaction of miR-122 with both target sites in the HCV 5´-UTR. A kinetic analysis showed that miR-122 stimulates HCV translation by accelerating and enhancing the formation of 48S translation initiation complexes with the HCV RNA. In this context it could be shown that both HCV RNA and miR-122 are incorporated in the 48S complexes. The association of the HCV-RNA with ribosomes enhanced by miR-122 at later stages of the initiation phase was confirmed in cell-free extract as well as in living HeLa cells.
The activation of HCV by interaction of miR-122 with sequences in the HCV 5´-UTR is one of the rare cases in which the binding of a microRNA leads to stimulation rather than repression of translation of its target RNA. Although the molecular mechanism is not yet understood, there is evidence that the modulation of microRNA function is mediated by the re-organisation of the microRNA effector complex. The search for factors that confer the stimulatory effect of miR-122 on translation of the HCV RNA resulted in the discovery of a protein of about 68 kDa. miR-122 competes with the binding of this protein to the HCV RNA. This protein could be identified as the Heat Shock Cognate 71 kDa Protein (Hsc70).
The results of this work complement observations from other studies and support the hypothesis that the liver-specific miR-122 considerably contributes to the liver tropism of HCV. Therefore, further analysis of the role of miR-122 in HCV translation may lead to new therapeutic approaches.