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Detection of NADPH oxidase subunits NOX1 and NOX4 in lung adenocarcinoma A549 cells, and impact of NOX1 on Nrf2- and HIF-1-dependent gene regulation

Nachweis der NADPH Oxidase Untereinheiten NOX1 und NOX4 in Lungen-Adenokarzinom A549 Zellen, und Einfluss von NOX1 auf Nrf2- und HIF-1-abhängige Genregulation

Malec, Viktor


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Medical Clinic II
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.03.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 22.04.2010
Kurzfassung auf Englisch: NADPH oxidase 1 and 4 are ROS generating enzyme complexes that play an important
role in cellular signaling. The core subunits of NADPH oxidase 1 and 4 are NOX1 and
NOX4, respectively.
The immuno-detection of NOX1 and NOX4 proteins is a commonly faced problem.
Protein bands of different molecular weights suggested to represent NOX1 and NOX4
have been described in previous studies. These bands could represent, for example,
different NOX splice variants, posttranslational modifications, proteolytic products or
non-specifically immunoreacting proteins. Thus, well validated NOX1 and NOX4
antibodies are critical for further functional and structural characterization of these
proteins. Based on this, the aims of the first part of the work were: 1. To test and to select
most suitable antibodies for the detection of NOX1 and NOX4 in human adenocarcinoma
A549, CaCo2 cells and HUVEC, 2. To determine the subcellular localization of NOX1
and NOX4, 3. To identify putative NOX1 and NOX4 proteins by mass spectroscopic
(MS) analysis.
Employing several commercially available and custom made NOX1 and NOX4
antibodies it was obvious that neither of the antibodies detected any common band.
Further, by employing specific siRNAs, custom made antibodies termed NOX1wch and
NOX4jh were identified as suitable for NOX1 and NOX4 detection. Using these
antibodies we also determined the presence of NOX1 and NOX4 in certain subcellular
fractions. The results showed that both NOX1 and NOX4 were predominantly localized
in the cytoskeleton fraction of A549 cells. This observation was partially in contrast to
previous studies demonstrating the presence of endogenous NOX1 in the membrane
fraction of different cell types including those that we used.
In addition to proteins of the predicted size, the NOX1wch and NOX4jh antibodies also
detected other protein species of lower or higher molecular weight. To identify these
additional bands and to confirm the identity of NOX1 and NOX4 full length proteins,
purification and MALDI-TOF MS analysis was performed. However, neither of the
analysed proteins were identified as NOX-related which does not mean that this is not the
case. This might be explained, for example, by low abundance of NOX1 and NOX4
proteins, or by technical limits of the protein purification and identification procedure.
Furthermore, we determined that NOX1 predominates in ROS generation in comparison
to NOX4 in A549 cells which was in accordance with a higher expression level of NOX1
mRNA than NOX4 mRNA in A549 cells.
In conclusion, this part of the work identified NOX1 and NOX4 antibodies that are
suitable for the detection of NOX1 and NOX4 by Western blot. These antibodies were
employed for the detection of NOX1 and NOX4 proteins in certain biochemical fractions
representing different subcellular compartments. Furthermore, the open attempt for the
purification and identification of NOX1 and NOX4 proteins was performed, and these
results may be considered as the basis for further proteomic experiments.
NADPH oxidase 1 is a significant source of ROS in A549 cells. ROS are involved in the
regulation of the transcription factors HIF-1 and Nrf2. Trx1 represents a target gene of
Nrf2 that is known to induce HIF-1a. Intermittent hypoxia occurs in different
pathophysiological conditions and is characterized by fluctuations of oxygen and ROS
levels with impact on both HIF-1 and Nrf2.
In this context, the aims of this part of the study were: 1. To analyse the expression of
NOX1, HIF-1a, Nrf2 and Trx1 under different conditions of oxygenation in A549 cells,
2. To analyse possible cross-talk(s) between these components, particularly under
conditions of intermittent hypoxia.
Initial experiments revealed, that whereas HIF-1a was up-regulated both in continuous
and intermittent hypoxias, the Nrf2, Trx1 and NOX1 as well as NOX1-derived ROS were
only up-regulated in intermittent hypoxia. NOX1 was determined as crucial for enhanced
ROS production in intermittent hypoxia that in turn mediated induction of Nrf2 and Trx1.
The regulation of Nrf2 and Trx1 by NOX1 was confirmed by both inhibition of
endogenous NOX1 and overexpression of recombinant NOX1 protein. Employing a
proteosomal inhibitor, NOX1 was demonstrated to activate Nrf2 at the level of protein
stability. Subsequently, Nrf2-dependent Trx1 induction turned out to enhance HIF-1a
signaling in intermittent hypoxia.
In sum, we identified a signal transduction pathway that causes the enhancement of HIF-
1a mediated by NOX1, Nrf2 and Trx1 in response to intermittent hypoxia.
Kurzfassung auf Deutsch: NADPH Oxidase 1 und 4 sind ROS generierende Enzymkomplexe mit einer wichtigen
Funktion in der Signaltransduktion. Die wesentlichen Untereinheiten sind NOX1 und
NOX4.
Die Immunodetektion von NOX1 und NOX4 ist problematisch. Proteinbanden mit
verschiedenem Molekulargewicht wurden beschrieben. Diese Banden könnten
verschiedene Splicevarianten, posttranslationale Modifikationen, proteolytische
Spaltprodukte oder unspezifische Proteine darstellen. Daher sind gut validierte NOX1
und NOX4 Antikörper wesentlich für weitere funktionelle und strukturelle
Untersuchungen von NOX1 und NOX4. Darauf basierend waren die Ziele des ersten
Teils der Arbeit 1. Verschiedene Antikörper für NOX1 und NOX4 zu testen und
möglichst geeignete Antikörper für den Nachweis von NOX1 und NOX4 in humanen
Adenokarzinom- und HUVEC Zellen auszuwählen, 2. Die subzelluläre Lokalisation von
NOX1 und NOX4 zu identifizieren, 3. Mögliche NOX1 und NOX4 Proteine durch
Massenspektroskopie zu identifizieren
Unter Einsatz verschiedener kommerziell erhältlicher und custom made NOX1 und
NOX4 Antikörper war es offensichtlich, dass mit keiner der verwendeten Antikörper
übereinstimmende Banden detektiert wurden. Basierend auf der spezifischen Inhibition
von NOX1 und NOX4 mit siRNA wurde ein NOX1 Antikörper (NOX1wch) und ein
NOX4 Antikörper (NOX4jh) als geeignet für den Nachweis von NOX1 und NOX4
identifiziert. Mit diesen Antikörpern wurden NOX1 und NOX4 in verschiedenen
subzellulären Fraktionen detektiert und analysiert. Dabei zeigte sich, dass sowohl NOX1
als auch NOX4 vorwiegend in Fraktionen des Zytoskeletts enthalten war. Diese
Beobachtung steht teilweise im Kontrast zu Studien, die das Vorhandensein von NOX1
und NOX4 in den Membranfraktionen verschiedener Zelltypen (die von uns benutzten
eingeschlossen) fanden.
Außerdem wurden mit den Antikörpern NOX1wch und NOX4jh andere Proteinspezies
mit abweichenden Molekulargewichten detektiert. Diese Proteine und die mit erwartetem
Molekulargewicht wurden nach verschiedenen Aufreinigungsschritten mit MALDI-TOF
MS analysiert. Jedoch konnte keiner dieser Proteinbanden als NOX Protein identifiziert
werden, was jedoch nicht heißt, dass es sich nicht um NOX Proteine handelt. Dies kann
durch das geringe Vorkommen von NOX1 und NOX4 oder durch die Grenzen der
verwendeten Proteinaufreinigung und Identifizierung bedingt sein.
Außerdem wurde in der Studie aufgezeigt, dass NOX1 im Vergleich zu NOX4 die
wesentliche ROS Quelle in A549 Zellen darstellt, was im Einklang mit den erhöhten
mRNA Spiegeln von NOX1 im Vergleich zu NOX4 ist.
Zusammenfassend wurden in diesem Teil der Arbeit Antikörper gegen NOX1 und NOX4
identifiziert, die geeignet sind für den Nachweis von NOX1 und NOX4 im Western Blot.
Diese Antikörper wurden dazu genutzt, um NOX1 und NOX4 Proteine in biochemischen
Fraktionen, die verschiedene subzelluläre Kompartimente repräsentieren nachzuweisen.
Außerdem wurde der noch offene Versuch der Aufreinigung und Identifizierung von
NOX1 und NOX4 Proteinen durchgeführt, dessen Ergebnisse, die Grundlage für
weitergehende Experimente in diese Richtung darstellen.
NADPH Oxidase 1 ist eine signifikante Quelle von ROS in A549 Zellen. ROS sind an
der Regulation der Transkriptionsfaktoren HIF-1 und Nrf2 beteiligt. Trx1 repräsentiert
ein Zielgen von Nrf2, das bekanntermaßen HIF-1a induziert. Der zyklische Wechsel von
Normoxie und Hypoxie (intermittent hypoxia) kommt unter verschiedenen
pathophysiologischen Bedingungen vor und ist durch Fluktuationen der Sauerstoff und
ROS Spiegel mit Einfluss auf HIF-1 und Nrf2 gekennzeichnet. In diesem Zusammenhang
waren die Ziele dieses Teils der Arbeit: 1. Die Expression von NOX1, HIF-1a, Nrf2 and
Trx1 unter verschiedenen Oxygenierungsbedingungen in A549 Zellen zu analysieren, 2.
Eine mögliche Interaktion dieser Komponenten insbesondere in intermittent hypoxia zu
untersuchen. Es zeigte sich, dass HIF-1a sowohl nach andauernder Hypoxie als auch
nach intermittent hypoxia hoch reguliert war während Nrf2, Trx1, NOX1 und NOX1-
abgeleitete ROS nur nach intermittent hypoxia hoch reguliert waren. NOX1 erwies sich
dabei als entscheidend für die erhöhte ROS Generierung in intermittent hypoxia, die
nachfolgend für die Induktion von Nrf2 und Trx1 relevant war. Die Regulation von Nrf2
und NOX1 wurde bestätigt durch die Inhibition von endogenem NOX1 und die
Überexpression von rekombinantem NOX1. Durch Verwendung eines Proteasom
Inhibitors konnte gezeigt werden, dass NOX1 Nrf2 auf der Ebene der Proteinstabilität
induziert. Nachfolgend, verstärkt die Nrf2-abhängige Induktion von Trx1 die HIF-
1a Antwort in intermittent hypoxia.
Zusammenfassend wurde ein Signaltransduktionsweg aufgezeigt, der die HIF-1a
Antwort in NOX1-, Nrf2- und Trx1-abhängiger Weise unter Bedingungen von
intermittent hypoxia verstärkt.