Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

Hinweis zum Urheberrecht

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-75066
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2010/7506/


Vergleichende Untersuchungen von zwei phänotypischen und einem genotypischen Nachweisverfahren zur Detektion von ZNS-Risikogewebe in Fleisch und Fleischerzeugnissen

Göbel, Katrin-Annette


Originalveröffentlichung: (2010) Giessen : VVB Laufersweiler
pdf-Format: Dokument 1.pdf (1.431 KB)

Bookmark bei Connotea Bookmark bei del.icio.us
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5518-9
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.02.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 09.04.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Vor dem Hintergrund der Übertragbarkeit des BSE-Erregers vom Rind auf
den Menschen müssen gemeinschaftsweit spezifizierte Risikomaterialien
von Wiederkäuern aus der Nahrungsmittelkette entfernt, gekennzeichnet
und unschädlich beseitigt werden. Dies wird durch die VO (EG) 999/2001
festgelegt. Aufgrund ihrer besonders hohen Infektiösität kommt dem
bovinen Gehirn und Rückenmark innerhalb der spezifizierten
Risikomaterialien eine besondere Bedeutung zu. Um die Einhaltung der
gesetzlichen Vorgaben überwachen und zusätzlich bereits präventiv
betriebliche Eigenkontrollen durchführen zu können, wird ein
zuverlässiges, sensitives und anwenderfreundliches Verfahren zum
Nachweis von zentralem Nervengewebe (ZNS) in Fleisch und
Fleischerzeugnissen benötigt.
Im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit wurden drei Verfahren zum
Nachweis von ZNS-Gewebe in Fleisch und Fleischerzeugnissen
miteinander verglichen. Dabei handelte es sich um zwei ELISA-Verfahren
zum Nachweis von GFAP: den RIDASCREEN® Risk Material-Test von Rbiopharm
(Darmstadt) und den Brainostic™ von ScheBo® (Gießen), sowie
eine am Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde der Universität
Gießen entwickelte Reverse Transkriptase-Real Time-PCR. Als
Untersuchungsmaterial wurden unterschiedliche Fleischerzeugnisse
artifizell mit Rinderhirn bzw. Rinder-Rückenmark in verschiedenen
Konzentrationsstufen kontaminiert und vergleichend aufbereitet. Um den
Einfluss unterschiedlicher Parameter auf die Stabilität der jeweiligen
Markersubstanz beobachten zu können, wurden sowohl natives
Hackfleisch, tiefgefroren aufbewahrtes Hackfleisch wie auch
unterschiedlich stark hitzebehandeltes Untersuchungsmaterial in den
Vergleich mit einbezogen. Das Untersuchungsmaterial wurde über
entsprechend ausgewählte Lagerungsperioden wiederholt aufbereitet. Die
Lagerungszeiten reichten von 14 Tagen bei frischem Hackfleisch bis zu 24
Monaten bei Vollkonserven.
Insgesamt wurden jeweils 204 Hackfleischproben, 50 Vollkonserven, 50
Dreiviertelkonserven und 64 Kesselkonserven vergleichend aufbereitet. In

den Untersuchungen des nicht hitzebehandelten Probenmaterials zeigte
das Reverse Transkriptase-Real Time-PCR-Verfahren die höhste
Empfindlichkeit. Mit dem Brainostic™-ELISA wurden in den
Untersuchungen von mit Rinderhirn versetztem Hackfleisch vereinzelte
falsch-negative Ergebnisse beobachtet. Die mit Rinder-Rückenmark
versetzten Hackfleischproben konnten mit diesem Verfahren ausnahmslos
nachgewiesen werden. Eine etwas geringere Empfindlichkeit zeigte sich
bei dem RIDASCREEN® Risk Material 10/5-ELISA. Obwohl durch eine
Modifikation der Probenaufbereitung die Nachweisbarkeit mit diesem
Verfahren verbessert werden konnte, blieb es doch in der Empfindlichkeit
hinter den anderen Verfahren zurück.
Dieser deutliche Unterschied in der Sensitivität der verwendeten
Nachweisverfahren zeichnete sich in den Untersuchungen von
Brühwurstkonserven nur noch tendentiell ab und war nicht statistisch
signifikant.
Die Ergebnisse der Untersuchungen von Leberwurst-Kesselkonserven
deuteten darauf hin, dass die Beschaffenheit dieses Referenzmaterials
einen erheblichen Einfluss auf die Empfindlichkeit der Nachweisverfahren
ausübte. Hier lag die Empfindlichkeit beider ELISA-Verfahren über der des
molekularbiologischen Verfahrens.
Die Analysen zur Stabilität der Markersubstanzen GFAP-mRNA und
GFAP-Protein stehen in guter Übereinstimmung zur aktuellen
wissenschaftlichen Literatur. Es konnte gezeigt werden, dass
insbesondere die GFAP-mRNA einen in hohem Maß spezifischen und
stabilen Marker zum Nachweis von ZNS-Gewebe darstellt.
Die zusätzlichen Untersuchungen von Feldproben belegte das
Vorhandensein von schlachttechnologisch bedingter ZNS-Kontamination
an Rinderköpfen und Rinderschlachttierkörpern.
Kurzfassung auf Englisch: Bovine spongiforme encephalopathy was diagnosed in Great Britain in
1986 for the first time. The new variant of Creutzfeldt-Jakob-Disease was
described in 1995 first. Today it is unquestioned that BSE can be
transmitted from cattle to humans via oral intake of the infectious agent
(prions). Several lines of evidence have shown that BSE-agent can be
transmitted to humans via food chain, leading to the new variant CJD.
Especally bovine brain and spinal cord are highly infectious because they
are preferred targets for BSE-agent. Against this background European
legislation prohibited specified risk material (offals, SBO) from food chain.
It is necessary to determine a reliable detection methode for CNS-tissue to
control the ban of SBO in food and to offer an instrument for selfcontrol to
food manufacturers. In this study three different methodes for the detection
of CNS-tissue in meat and meat products were compared:
RIDASCREEN® Risk Material-ELISA (R-biopharm, Darmstadt),
Brainostic™-ELISA (ScheBo®, Gießen) and a Reverse Transcriptase-Real
Time-PCR (Institute of Food Science, University Gießen). Both ELISAsystems
are based on detection of GFAP while the Reverse
Transcriptase-Real Time-PCR uses a robust sequence region of GFAPmRNA
as CNS-specific marker.
As reference material different types of meat products were spiked with
bovine brain or spinal cord in various concentrations. The studys aimed to
measure the influence of various parameters, like storing period, heat
treatment or composition to the stability of GFAP respectively GFAPmRNA.
The analyses included minced meat, deep-frozen minced meat
and heat treated canned meat productes. Each reference material was
analysed over a determined periode: minced meat was stored for 14 days
while canned meat products were stored for up to 24 month. A total of 204
samples of minced meat, 50 samples of canned meat products with Fvalue
> 5, 50 canned meat products with F-value 0,84 and 56 canned
meat products with F-value 0,48 were analysed with each detection
method. Reverse Transcriptase-Real Time-PCR showed to be the most
sensitive detection methode for analysing not heat treated reference
143
material. In analysis of not heat treated reference material containing
bovine brain with the Brainostic™-ELISA some false-negative results were
found, even if this detection methode was abel to detect all samples
spiked with bovine spinal cord. The RIDASCREEN® Risk Material 10/5-
ELISA showed a lower sensitivity, although a modification in sample taking
improved the sensitivety of this test. No false-positive results were
observed with either test using the manufactures´analytical protocols.
Significant differences in sensitivety were not found in analysis of boiled
sausages. Results of analysing canned liver sausage pointed out that this
fatty and enzyme-rich matrix had a massive influence on sensitivety of the
biomolecular test system. Although this reference material was only heat
treated at low temperatures, it was difficult to detect small amounts of
CNS-tissue with the Reverse Transcription-Real Time-PCR. Both ELISAsystems
did not have a loss of sensitivety in this matrix.
This study showed that GFAP-mRNA as well as GFAP are highly specific
and stable marker substances for detection of CNS-tissue and all three
detection methods were useful for routine diagnostic of CNS-tissue in
meat and meat products.