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Generierung und Charakterisierung eines neuen Tiermodells für Zellweger Syndrom (PEX19 KO-Maus) zum Studium der peroxisomalen Membranbiogenese

Beck, Anja Christina


Originalveröffentlichung: (2009) Giessen : VVB Laufersweiler 2010
pdf-Format: Dokument 1.pdf (5.253 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Anatomie und Zellbiologie II
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5571-4
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.10.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 24.02.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Peroxisomen sind Zellorganellen, die in allen eukaryotischen Zellen vorkommen. Ihre
Hauptfunktionen liegen im Intermediärstoffwechsel reaktiver Sauerstoffverbindungen, dem
Abbau verschiedener Fettsäuren, von Eicosanoiden, Leukotrienen, Glycero- und Etherlipiden
sowie von Cholesterin. Sind Peroxisomen des Menschen in ihrer normalen Funktion gestört,
kommt es zu einer Reihe von schwerwiegenden, immer tödlich verlaufenden Erkrankungen. Die
schwerste Form einer peroxisomalen Erkrankung, das cerebrohepatorenale Syndrom oder auch
Zellweger Syndrom, entsteht durch fehlerhafte Biogenese dieser Zellorganellen und dem damit
verbundenen kompletten Ausfall aller peroxisomaler Stoffwechselwege. Da peroxisomale
Stoffwechselwege auch andere Zellorganellen (z.B. glattes endoplasmatisches Retikulum,
Mitochondrien, Cytoplasma) mit einschließen, scheitern häufig biochemische Untersuchungsmethoden.
Das gezielte Ausschalten von Genen für die Peroxisomenbiogenese mit Hilfe
moderner gentechnischer Methoden ermöglicht jedoch die Analyse der molekularen Folgen
einer Peroxisomen-Defizienz. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine sog. Knockout (KO)-Maus
mit PEX19-Defekt hergestellt, und die Rolle des cytoplasmatischen Pex19p-Proteins bei der
peroxisomalen Membransynthese untersucht.
Bisher wurden drei Proteine der Peroxinfamilie (Pex3p, Pex16p, Pex19p) mit der Synthese der
peroxisomalen Membran in Verbindung gebracht. Das Pex19p spielt als cytoplasmatisches
Chaperon und Shuttle-Rezeptor für peroxisomale Membranproteine bereits im frühen Stadium
der Membranentstehung dieser Organellen eine wichtige Rolle. Sowohl durch histologische als
auch durch biochemische Analysen konnte nachgewiesen werden, dass diese Maus ähnliche
phänotypische Merkmale zeigt, wie sie in bisher etablierten Knockout-Mausmodellen mit
Matrixproteinimportdefekten oder auch bei Patienten mit Zellweger Syndrom beschrieben
wurden. Mit dieser PEX19 KO-Maus konnten zellbiologische Untersuchungen in Bezug auf
peroxisomale Membranreststrukturen („ghosts“) und auf den zielgerichteten Einbau
peroxisomaler Membran- und Matrixproteine („targeting“) durchgeführt werden. Weiterhin
wurden bisher unbekannte Veränderungen im Muster von mehrfach ungesättigten Fettsäuren
nachgewiesen.
Im Zuge der phänotypischen Charakterisierung wurde nachgewiesen, dass bei Abwesenheit von
Pex19p der Import von peroxisomalen Membran- und Matrixproteinen gestört ist. So werden
verschiedenste peroxisomale Membranproteine in andere Organellen (z.B. Mitochondrien)
fehlgeleitet, und Matrixproteine verbleiben im Cytoplasma oder werden komplett abgebaut.
Darüber hinaus konnten in Hepatocyten der PEX19 KO-Mäuse knäuelartige Lipid-
Membranstrukturen in der Nähe von Glykogenfeldern nachgewiesen werden, an denen in
Wildtyptieren normale Peroxisomen zu finden sind. Diese Strukturen wurden bisher in keiner
Fibroblastenzelllinien von Patienten mit Defekten in den an der Membranbiogenese beteiligten
peroxisomalen Proteinen Pex3p, Pex16p und Pex19p beschrieben.
In dieser Studie wurden außerdem fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zur Ablauf der
Neuentstehung von Peroxisomen in primären embryonalen Fibroblasten von PEX19 KOMäusen
durchgeführt, die ein eindeutiges Muster bei der Peroxisomenentstehung und –reifung
vermuten lassen.
Kurzfassung auf Englisch: Peroxisomes are ubiquitous organelles, present in all eukaryotic cells. They play an essential
role in several important metabolic processes, such as the degradation of reactive oxygen
species, the breakdown of toxic and bioactive fatty acids, or the synthesis of eicosanoids
leucotriens, glycerolipids, ether lipids and cholesterol. The vital importance of this organelle
for normal cellular homoestasis and the survival of the whole organism are highlighted by
several lethal inherited autosomal-recessive diseases known as peroxisomal biogenesis
disorders of the Zellweger Syndrome spectrum. Because peroxisomes are functionally crosslinked
to other cell compartments, such as smooth endoplasmatic reticulum, mitochondria
and cytoplasm, biochemical analysis are often not successful to study the function of this
organelle. In contrast, the knockout of peroxisomal biogenesis genes by genetic engineering
allows studying the molecular consequences of peroxisomal deficiency. In the present study,
knockout (KO) mice with Pex19p-deficiency have been generated to study the role of the
Pex19p protein during peroxisomal membrane biogenesis.
Three peroxins, Pex3p, Pex16p and Pex19p, are suggested to be involved in the early steps
of peroxisomal membrane biogenesis. A bifunctional role of Pex19p as a chaperone and as
an import receptor for peroxisomal membrane proteins at the peroxisomal membrane has
been proposed. Several histological and biochemical analyses revealed that the newly
generated PEX19 KO mice exhibited a phenotype similar to formerly established knockout
mouse models with peroxisomal matrix protein import defects and patients with Zellweger
syndrome. However, the PEX19 KO mouse showed cell biological differences in relationship
to peroxisomal residual membrane structures (“ghosts”) and the targeting of peroxisomal
membrane proteins. Furthermore hitherto unknown changes in levels of polyunsaturated fatty
acids have been detected.
Phenotypical characterisation revealed that PEX19 knockout mice exhibited an import defect
of both peroxisomal membrane and matrix proteins. Peroxisomal membrane proteins were
mistargeted to other organelles like mitochondria, whereas peroxisomal matrix proteins were
mislocalised to the cytoplasm and the nucleus or were degraded. In addition in hepatocytes
of the PEX19 KO mice loop- or whorl-like membrane structures, suggestive for peroxisomal
“membrane ghosts”, were detected in the vicinity of glycogen areas, where normal
peroxisomes would be located in wildtype animals. This is the first description of these
residual membrane structures, which have not been found in corresponding human patient
fibroblasts before.
Furthermore, the kinetic of peroxisomal membrane and matrix protein import was studied by
immunofluorescence analyses in primary cultures of embryonic mimmunofluorescence analyses in primary cultures of embryonic mouse fibroblasts at different
time-points after complementation with PEX19-cDNA.