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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-74289
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2010/7428/


Methodenoptimierung für die automatisierte Proteinidentifikation

Bender, Björn Heiko


Originalveröffentlichung: (2009) Giessen : VVB Laufersweiler 2010
pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.973 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Biochemisches Institut
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5564-6
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.12.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 08.02.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Die medizinische Forschung braucht für das Verständnis von Pathomechanismen, bei der Entwicklung von Pharmaka, bei der Erforschung der Funktionen in Infektionserregern und bei der Erforschung zellulärer Antworten auf Infektionen die Methoden der Proteinanalytik. In diesem Zusammenhang sind ganze Proteome von Interesse, da die Zusammenhänge in der Zelle für das globale Geschehen entscheidend sind. Um ein Proteom, also eine Vielzahl an Proteinen möglichst effizient analysieren zu können ist die Automatisierung und Optimierung des Analyseprozesses von entscheidender Bedeutung. In dieser Arbeit wurden einzelne Schritte der MALDI-Analyse des proteolytischen Verdaus variiert und optimiert. Veränderungen der Proteinidentifikationsrate durch Entfärben von silbergefärbten Gelstücken wurden untersucht. Reaktionszeit und Temperatur des enzymatischen Verdaus wurden variiert. Veränderungen der Proteinidentifikation durch verschiedene Zusätze wie Calcium, Octylglycosid oder Acetonitril im Verdaupuffer wurden beobachtet. Für den Extraktionsschritt wurden Untersuchungen zum Vergleich von Ultraschallextraktion zu Schüttlerextraktion durchgeführt, um ein optimales Auslösen der Peptide zu ermöglichen. Das Volumen der Extraktionslösung wurde variiert. Der Effekt von Acetonitril auf die Extraktion wurde untersucht. Unterschiedliche Matrixpräparationen wurden an C.elegans-Proteinen getestet. Untersuchungen zur automatischen MALDI-Messung wurden an den verschiedenen Matrices durchgeführt. Zur Auswertung wurden verschiedene Suchmaschinen und Datenbanken verwendet. Es zeigte sich, dass automatisierte Methoden in der Proteinanalytik hervorragend einsetzbar sind. Die Anzahl der identifizierten Proteine mit einer automatisierten Methode war vergleichbar mit der eines manuellen Protokolls. In dieser Arbeit zeigte sich, dass verschiedene Zusätze zu den Verdaupuffern tendenziell eher wenig Vorteile bringen. Ein möglichst kurzer Verdauprozess mit möglichst wenigen Zwischenschritten ist von Vorteil. Für Datenbanksuchen und die Verwaltung der Proteinidentifikationen sind gute Softwarelösungen entscheidend.
Kurzfassung auf Englisch: Sophisticated protein analytical techniques are an essential for the understanding of diseases’ pathogenesis, the development of new pharmaceutics, functional investigation of infectious agents and for investigating cellular responses towards pathogens. As intracellular interactions and replies are responsible for the progress and outcome of diseases, complete proteoms are of special interest. For the efficient analysis of such a proteom, the establishment of automated and optimized methods of the analytic process is of particular importance. In this thesis, single steps of the MALDI-analysis of proteolytic digests were varied and optimized. The influences on the protein identification rate by destaining silver-gels were investigated as well as variations of the reaction time and temperature. Moreover, application of calcium, octylglycoside and acetonitrile to the digestion buffer provoked changes in the identification of proteins. Extractions by ultrasonic and by shaking were compared in order to bring more peptides in solution. The volume of the extraction buffer was varied and the effect of acetonitrile on the extraction was studied. Different matrix-preparations were examined using C.elegans peptides. The differences of matrix-preparations concerning automated MALDI measurements were also studied. Different protein search engines and databases were compared. It turned out that in protein analysis automated methods are very successful. The protein identification rate by the automated protocol was comparable to an established manual protocol. This work shows that most of the used buffer additives reported so far are of no remarkable positive effect on the protein identification. Instead, a short and uninterrupted protocol containing only few steps is of greater importance. For database searches and management of the results, new handy software solutions are needed.