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Toxin-vermittelte Ablation von Kardiomyozyten in vivo : Ein genetisches Modell zur Untersuchung von Remodeling Vorgängen im Herzen von Mus musculus

Hartmann, Christian


Originalveröffentlichung: (2009) Giessen : VVB Laufersweiler
pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.926 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär- Physiologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5513-4
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.12.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 20.01.2010
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit wurde ein Kardiomyozytenablationsmodell entwickelt, das auf einer Manipulation des Mäusegenoms über das CreERT2/LoxP-Rekombinationssystem basiert. Es wurden doppelt heterozygote Mäuse mit dem Genotyp MerCreMer/DTA verwendet. Über die Bindung des Liganden Tamoxifen (TMX) an mutierte Östrogenrezeptoren erfolgte eine Expression der Cre-Rekombinase. Durch die Bindung der Cre-Rekombinase an loxP-Erkennungsstellen der transgenen Tiere resultierte eine Produktion von Diphtheria-Toxin A (DTA). Die Expression des DTA-Gens war durch die Verwendung herzspezifischer Promotoren auf die Kardiomyozyten beschränkt und konnte über den Liganden TMX gezielt im adulten Mäuseherzen hervorgerufen werden.Es erfolgte eine Ablation von Kardiomyozyten aus dem Gewebeverband des Herzens.
Anhand von Hämatoxylin-Eosin (H.E.) Färbungen an Gewebeschnitten der Herzen der
transgenen Mäuse wurde zunächst in Vorversuchen die Stärke der Ablation bestimmt
und die für die Modelletablierung günstigste TMX-Dosis ermittelt. Mit der ermittelten Dosis von 500 Mü g TMX (über drei Tage per diem) wurden mit den MerCreMer/DTA transgenen Tieren und korrespondierenden Wildtyptieren das Modell etabliert und charakterisiert. Histologische Untersuchungen erfolgten eine, vier und acht Wochen nach TMX- Induktion. Anhand von H.E. Färbungen zeigte sich, dass sich die durch die Ablation der Kardiomyozyten entstandenen Freiflächen im Gewebeverband zunehmend durch reparative Prozesse schlossen. Durch den immunhistochemischen Nachweis der extrazellulären Matrixproteine Kollagen VI und Fibronektin konnte eine zunehmende Fibrose im Myokard nachgewiesen werden. Gleichzeitig zeigte sich in den MerCreMer/DTA transgenen Tieren eine Woche nach erfolgter Ablation von Kardiomyoyzyten eine massive Invasion durch Gewebsmakrophagen (immunhistochemischer Nachweis mittels primärem CD68- Antikörper), deren Anzahl vier und acht Wochen nach TMX-Induktion wieder abfiel. Als Stressreaktion auf die
entstandene pathologische Situation im Myokard exprimierten die Kardiomyozyten das physiologischerweise nur fetal exprimierte Smooth muscle (SM) alpha-Aktin. Die Expression war eine Woche nach TMX-Induktion am höchsten und fiel auf ein niedriges Niveau nach vier, bzw. acht Wochen ab. Anhand des immunhistologischen Nachweises des Transkriptionsfaktors Islet-1 wurde zu den Untersuchungszeitpunkten eine, vier und acht
Wochen nach erfolgter TMX- Induktion das Vorkommen möglicher Vorläuferzellen als
Hinweis regenerativer Prozesse im Myokard überprüft. Der Nachweis Islet-1
exprimierender Zellen blieb zu allen Zeitpunkten erfolglos.
Flankierend zu den histologischen und immunhistologischen Untersuchungen wurden
Untersuchungen mittels eines speziellen Magnetresonanztomographen (MRT)
durchgeführt, um den Einfluss der Kardiomyozytenablation auf die Herzfunktion zu
bestimmen. Es zeigte sich ab der dritten Woche nach erfolgter TMX-Induktion eine
deutliche Zunahme des endsystolischen Volumens im linken Ventrikel. Das
enddiastolische Volumen zeigte über den gesamten Zeitraum nur marginale
Schwankungen. Durch die Kardiomyozytenablation und das voranschreitende
Remodeling im Myokard verschlechterte sich die Herzfunktion ab der dritten Woche
nach TMX-Induktion, was sich durch eine deutlich verminderte Auswurffraktion im MRT nachweisen lies.
Kurzfassung auf Englisch: In this study, a cardiomycyte ablation model based on the CreERT2-recombinationsystem to manipulate the mouse genome was developed. In this model, the crerecombinase was activated by the ligand Tamoxifen (TMX), which binds to the loxP-sites and activates the Diphteria Toxin subunit A (DTA) exclusively in cardiomyocytes via a heart-specific promotor. The study was conducted using MerCreMer/DTA transgenic mice, which were administered an evaluated dose of 500 μg of TMX per diem for the period of three days.
To study regenerative and reparative processes in the damaged heart, a series of
histological and immunohistochemical analyses was performed one, four and eight
weeks after the first TMX-application and DTA-expression.
The ablated cardiomyocytes and the cardiomyocyte-free areas in the heart tissue were monitored by hematoxylin-eosin staining. After one week, a strong ablation of the cardiomyocytes coupled with large cardiomyocyte-free areas was detected. After four and up to eight weeks post TMX-application, the cardiomyocyte-free areas decreased and were filled up during reparative processes.
Using immunohistochemical detection of the extracellular matrix components, collagen VI and fibronectin, an increasing fibrosis of the myocardium during the observation period was found. Simultaneous to the fibrosis of the myocardium, a high number of macrophages (immunohistochemical detection of CD 68-antigen) was found after ablation of the cardiomyocytes one week after TMX-application. The number of macrophages decreased from one week to eight weeks after TMX-application.
In response to the biochemical stress, many cardiomyocytes expressed the protein
smooth muscle alpha actin, which is normally absent in adult cardiomyocytes but can be found in neonatal cardiomyocytes. Smooth muscle alpha actin showed a high
expression one week after TMX-application and decreased to a lower level four and eight weeks after TMX-application.
To study regenerative processes during remodelling after ablation of cardiomyocytes, the presence of possible precursor cells was determined. Therefore, immunohistochemical detection of the Islet 1-antigen was performed, but positive cells were not found after one, four and eight weeks post TMX-application.
To study the functional effects of cardiomyocyte-ablation on the heart, a small animal magnetic resonance imager (MRI) was used. It was shown that the ejection fraction (EF) of the left ventricle strongly decreased. The EF started to decline three weeks after TMX-application and reached the lowest level eight weeks after TMX-application.