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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-73178
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2009/7317/


Einfluss von nicht-steroidalen Antiphlogistika auf die Vitalität, Proliferation und Differenzierungsfähigkeit von equinen mesenchymalen Stammzellen

Müller, Maike


Originalveröffentlichung: (2009) Giessen : VVB Laufersweiler
pdf-Format: Dokument 1.pdf (4.542 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Anatomie; Institut I für Anatomie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5509-7
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 21.12.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Osteoarthritiden und Sehnenverletzungen sind häufige Gründe für eine erhöhte
Morbidität und verminderte Leistungsfähigkeit bei Pferden und Kleintieren.
Aufgrund der langen Regenerationszeit, die das Gewebe für die Eigenregeneration
benötigt, ist eine Auswahl an Therapiemöglichkeiten mit kürzerer Regenerationszeit und somit mit schnellerer Belastbarkeit der Strukturen unabdingbar.
Zu den mittlerweile gebräuchlichen Therapieansätzen, die sich von der konservativen Therapie bis hin zum Einsatz von Ersatzmaterialien beläuft, ist es eine interessante und vorteilhafte Alternative körpereigene Zellen aufzuarbeiten und diese in Form eines Transplantates in den Defekt einzubringen. Zu den möglichen, körpereigenen Zellen, gehören auch pluripotente MSC aus dem Knochenmark.
Die Gewinnung der eMSC ist, unter Praxisbedingungen, sowohl beim liegenden als
auch beim stehenden Pferd durchführbar.
In einigen Praxen ist die Verwendung von autologen eMSC zur Therapie eines
Sehnendefektes bereits standardmäßig im Angebotskatalog enthalten.
Im Rahmen dieser Therapie ist es üblich, die Pferde mit NSAID vorzubehandeln. Um
herauszufinden, welche Folgen die Substanzen für die eMSC haben, wurden diese
mit verschiedenen NSAID’s kultiviert und die Effekte analysiert.
Nach Isolation der eMSC aus dem Knochenmark wurden die Zellen in einer Zellkultur aufgereinigt und expandiert. Mit Erreichen einer ausreichend großen Zellzahl wurden die Inkubationsversuche mit den NSAID durchgeführt. Die Zellen sollen nach ihrer Reimplantation noch begrenzt proliferieren und sich differenzieren können. Deshalb wurde, in Form einer Langzeitkinetik, untersucht, welchen Einfluss längerfristige NSAID- Zugaben auf die Vitalität und Proliferation der eMSC haben. Innerhalb von sechs Passagen konnten, bis auf eine Ausnahme, keine Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Zellen festgestellt werden. Ausschließlich eine Flunixinbehandlung verursachte einen Proliferationsrückgang und eine Reduktion der Zellzahlen. In Zurzeitkultivierungen von 24 Stunden wurde die Vitalität und
Proliferation mit Hilfe von photometrischen Assays für die Zellvitalität (WST-1) und die Proliferation (BrdU) untersucht. Bei NSAID- Zugaben in therapeutisch relevanten Konzentrationen zeigten sich Steigerungen bis zu 50 % im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Es konnten allerdings keine wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Wirkstoffen festgestellt werden. Durch die Beurteilung des Migrationsverhaltens wurden die Wirkstoffkonzentrationen ermittelt, die die Zellmigration deutlich hemmen. Es konnten, in den höheren Konzentrationen, eindeutig schädliche Einflüsse registriert werden. Elektronenmikroskopisch wurde beispielhaft die Morphologie von eMSC untersucht, die in Gegenwart von Phenylbutazon in unterschiedlichen Konzentrationen kultiviert wurden. Es konnten auch ultrastrukturell keine morphologischen Schäden aufgezeigt werden.
Bei der Beurteilung des Differenzierungspotentials unter NSAID- Einfluss war die
Fettdifferenzierung nicht auswertbar, weil die undifferenzierten Zellen die gleiche Menge an Fettvakuolen aufwiesen wie die differenzierten Zellen. Die chondrogene und die osteogene Differenzierung zeigten unterschiedliche Ergebnisse unter NSAID- Zugaben. Die chondrogene Differenzierung unter NSAID- Einfluss unterschied sich nicht von der unbehandelten Positivkontrolle mit chondrogenem Induktionsmedium. In der osteogenen Differenzierung zeigten sich deutliche Alterationen zwischen den unbehandelten Positivkontrollen und den behandelten NSAID- Zellen, wobei es noch Unterschiede zwischen den einzelnen
Wirkstoffgruppen gab. Die Zellen, die mit Cox- 2- selektiven Wirkstoffen behandelt wurden, zeigten das schlechteste Differenzierungsergebnis. Die klassischen, unselektiven Wirkstoffe zeigten etwas mehr differenzierte Bereiche und die besten Ergebnisse konnten in den unbehandelten Kontrollzellen erzielt werden. In der RTPCR wurde die Primer Runx2, für die osteogene Differenzierung, und die Primer Aggrecan, sowie Collagen II, für die chondrogene Differenzierung, detektiert. In einem weiteren Schritt wurden die behandelten und unbehandelten Pellets der chondrogenen Differenzierung elektronenmikroskopisch untersucht. Die Substanzen unterschieden sich im Zellerhalt und der Bildung von kollagenen Fasern nicht von der
unbehandelten Positivkontrolle mit dem chondrogenen Induktionsmedium, bis auf die Indomethacin- behandelte Probe. Die chondrogen differenzierten Zellen unter
Indomethacinzugaben, zeigten ultrastrukturell nur noch Zellmembran- und
Zellorganellreste, sowie fehlende kollagene Fasern.
Kurzfassung auf Englisch: Osteoarthritis and tendon lesions are frequent reasons for increased morbidity and reduced efficency of horses and small animals. Because of the long regeneration time of the tissue an assortment of therapy options leading to shorter regeneration times and therefore a faster capacitance of the structure are indispensable.
For current therapy approaches leading from the conservative therapy to the
application of alternative options it would be an interesting and advantageous
alternative to expand autologous cells and to transplant them into the lesion site.
Pluripotent MSC from the bone marrow belong to the relevant cells for autologous
implantation stategies.
The preparation of MSC is possible from the lying or standing horse under veterinary practice conditions. In some veterinary practices the application of autologous MSC for the therapy of tendon lesions is already widely used as a standard treatment.
As one part of the therapy, affected horses commonly receive a pre-treatment with non steroidal anti inflammatory drugs (NSAID). In order to find out whether these substances have an effect on MSCs, cells were cultivated in the presence of different NSAID in order to analyse any negative side effects.
After isolation of the eMSC from the bone marrow the cells were purified and
expanded in the cell culture. Because the cells should still be able to proliferate and differentiate at a moderate level after reimplantation into a recipient tissue for regeneration, the influence of a long-term NSAID application using different concentrations of the compounds was studied in regard to its effect on vitality and proliferation. With minor exceptions no difference between treated and untreated cells could be observed over six passages. However, Flunixin treatment lead to a significant decrease in cell proliferation and total cell number.
Vitality and proliferation were measured by short-term cultivation (24 hours) using the WST-1 and BrdU photometric assays. With the addition of therapeutically relevant concentrations of NSAID an increase in vitality and proliferation of about 50% was observed in comparison with untreated controls. There were no differences between the single additives.
The concentration of the additives which clearly blocked cell migration were
estimated using a migration assay. Obvious damaging effects were detected only at higher, unphysiological, NSAID concentrations.

Electron-microscopical studies were carried out in order to look at the morphology of eMSC that were grown in the presence of Phenylbutazon at different
concentrations.The results indicated that, using this compound, which is one major NSAID in equine medicine, also no morphological damages were apparent
ultrastructurally.
Looking for effects on the cellular differentiation capacity for the chondrogenic and osteogenic cell differentiation the addition of NSAID showed different results. The chondrogenic differentiation under NSAID influence showed no difference to the untreated positive control with the chondrogenic induction medium. The osteogenic differentiation clearly showed differences between the untreated positive controls and the NSAID-treated cells, with further differences between the single additive groups.
Those cells that were treated with Cox-2 selective additives showed the worst
differentiation result. The classical unselective additives showed more differentiated regions within the culture dish. The best results were achieved by the untreated controls. The estimation of the differentiation potential during NSAID treatment was not possible for the fat differentiation, as the undifferentiated cells showed the same amount of fat vacuoles like the differentiated cells.
Gene expression studies were carried out with RT-PCR for runx2 as osteogenic and
aggrecan and collagen I as condrogenic markers. Furthermore, the treated and
untreated cell pellets of the chondrogenic differentiation were investigated electron microscopically. In consideration of the cell structure and the formation of collagenous fibres the treated samples showed no difference to the untreated positive control which were grown in chondrogenic induction medium. However, the addition of Indomethacine resulted in an obvious damage of cells. Cells differentiated along the chondrogenic lineage ultrastructurally revealed lesions of the cell membrane and loss of organelles, as well as a lack of collagenous fibres.
In conclusion, this study shows that the NSAID have no obvious harmful effects on cell viability and proliferation of eMSC. However, for certain desired directions of differentiation the choice of the appropriate NSAID may have to be critically questioned. All together the presented data, however indicate, that NSAID are suitable for pre-treatment of horses with tendon lesions prior to reimplantation of autologous MSC.