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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-73013
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2009/7301/


The conformational dynamics of BsoBI, analyzed by fluorescence spectroscopy down to the single-molecule level

Analyse der konformationellen Dynamik der Restriktionsendonuclease BsoBI durch moderne fluoreszenzspektroskopische Methoden und Einzelmolekültechniken

Dikic, Jasmina


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie
Fachgebiet: Biochemie (FB 08)
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.12.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 10.12.2009
Kurzfassung auf Englisch: Enzyme flexibility is known to be crucial for various enzymatic functions. Conformational rearrangements have wide range of timescales, and are considered intrinsic features of all proteins. X-ray crystallography has provided important insight into different enzymatic conformations, but it can only give a snapshot of a complex protein life cycle. Fluorescence spectroscopy methods are becoming the primary methods in investigating protein structural dynamics, especially when combined with different single-molecule techniques.
Restriction endonucleases are important tools for every day laboratory work, being essential for all genetic engineering techniques. They are also model systems for studying protein/DNA interactions and one of the best studied families of proteins/enzymes. The main aim of this study was to investigate conformational changes of restriction enzyme BsoBI, during substrate binding and cleavage. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) was used to determine the changes in distances between donor and acceptor fluorophores during substrate binding and cleavage, in steady-state or pre-steady state ensemble, as well as in single-molecule experiments. These fluorophores were attached to single cysteine residues introduced to BsoBI subunits at specific positions.
BsoBI is a thermostable restriction enzyme, with optimal catalytic activity at 65 °C. Crystallographic studies had shown that BsoBI exists as a homodimer, which completely encircles specific DNA. The substrate is enclosed in a 20 Å long tunnel formed by the protein, which excludes access of water molecules from the solvent. Up to date, only the co-crystal structure of BsoBI with specific DNA is known, and there are no data indicating the conformational changes required for substrate binding and cleavage. The crystallographic data had shown that the interface between the catalytic domains of BsoBI is much weaker than the one between the helical domains, and it was proposed that the major conformational changes happen in the catalytic domain of the enzyme.
Steady-state experiments using double labeled BsoBI confirmed that the binding of DNA causes a conformational change in the catalytic domain of the enzyme. The addition of unlabeled specific DNA to the double labeled BsoBI variant A153C (positioned at the catalytic domain) caused a decrease in FRET signal. This result unexpectedly suggested that the fluorophores at the 153 position move apart upon specific substrate binding. The addition of DNA to the double labeled BsoBI variant E100C (positioned at the helical domain) did not cause change in the FRET signal, suggesting that this part of the enzyme does not change its conformation upon substrate binding. Suggested conformational change in the catalytic domain of BsoBI does not involve expected scissor-like motion of two subunits, but more complex “twisting” motion. These experiments also showed the influence of Ca2+ and Mg2+ ions on the conformation of the catalytic domain of BsoBI. The presence of Ca2+ induced a conformational change of the catalytic domain of the enzyme that moved two fluorophores at the positions 153 closer together, while the presence or the absence of Mg2+ did not cause any effect on the BsoBI conformation.
The conformational changes during substrate binding and cleavage, as well as the influence of different metal ions were analysed in pre-steady state experiments, using double labeled BsoBI and unlabeled DNA, or single labeled BsoBI and DNA. These experiments also confirmed the influence of DNA binding on the conformation of the catalytic domain of BsoBI. In addition, the kinetic model of DNA binding and cleavage revealed the existence of at least two conformations of the free enzyme before DNA binding. These two conformations were proposed to be substrate binding competent and substrate binding incompetent. The kinetic models also suggested that BsoBI binds Ca2+ and Mg2+ with different affinity, namely that Ca2+ binding is stronger and faster than Mg2+ binding.
The single-molecule experiments confirmed the existence of at least two different conformations of the apo-enzyme, and allowed quantifying the relative proportions of these subpopulations. The analysis of single-molecule experiments using different time windows demonstrated slow dynamics of different conformations of apo-enzyme, which was expected based on the observed influence of temperature on the KM value of BsoBI. Also, it was shown that the enzyme has more than one conformation when bound to the unspecific long substrate, suggesting different binding modes to the unspecific DNA.
By combining different fluorescence techniques, as well as different single cysteine variants, it was possible to explain and model single the conformational dynamics of substrate binding and cleavage by BsoBI. These experiments showed unexpected mechanism of the conformational changes, as well as the influence of different metal ions on the conformation of BsoBI.
Kurzfassung auf Deutsch: Die Flexibilität von Enzymen ist essentiell für verschiedene enzymatische Aufgaben. Diese Konformationsänderungen können dabei unterschiedliche Zeitskalen aufweisen, und werden als eine intrinsische Eigenschaft aller Proteine angesehen. Die Röntgenstrukturanalyse hat wichtige Erkenntnisse über diese unterschiedlichen Konformationen verschiedenster Enzyme geliefert, sie ermöglicht jedoch immer nur eine Momentaufnahme im komplexen Katalyseprozess. Es werden daher heutzutage vermehrt fluoreszenzspektroskopische Methoden, um die strukturelle Dynamik von Proteinen zu untersuchen.
Restriktionsendonukleasen sind wichtige Werkzeuge im molekularbiologischen Labor und essentiell für Anwendungen in der Gentechnik. Sie dienen jedoch auch als Modelsystem um Protein/DNA-Wechselwirkungen zu untersuchen. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Konformationsänderungen der Restriktionsendonuklease BsoBI beim Binden und Spalten der DNA zu untersuchen. Hierzu wurden ortsspezifisch einzelne Cysteinreste in beide Untereinheiten des Proteins eingebracht und diese mit spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen modifiziert. Untersuchungen des Fluoreszenz-Resonanzenergietransfers (FRET) zwischen Donor- und Akzeptorfluorophor ermöglichten, die Abstandsänderungen der Proteinuntereinheiten beim Binden und Spalten der DNA zu detektieren.
BsoBI ist ein thermostabiles Restriktionsenzym mit einem Temperaturoptimum für die katalytische Aktivität von 65 °C. Die Röntgenstrukturanalyse eines BsoBI x DNA-Komplexes hat gezeigt, dass das Protein als Homodimer die spezifische DNA vollständig umschließt. Das Substrat liegt dabei in einem 20 Å langen Tunnel, der durch das Protein gebildet. Bis heute ist nur die Kokristallstruktur des BsoBI x DNA-Komplexes bestimmt worden, aus der jedoch keine Hinweise auf die notwendigen Konformationsänderungen des Enzyms beim Binden und Spalten der DNA gezogen werden können. Die kristallographischen Daten zeigen nur, dass das Interface zwischen den beiden katalytischen Domänen, im Vergleich zu den beiden helikalen Domänen, wesentlich schwächer ausgebildet ist. Aufgrund dessen wurde vermutet, dass hauptsächlich Konformationsänderungen der beiden katalytischen Domänen die Substratbindung ermöglichen.
Steady-state FRET-Experimente mit doppelt markierten BsoBI bestätigten, dass die Bindung an die spezifische DNA eine Konformationsänderung zwischen den beiden katalytischen Domänen bewirkt. Die Zugabe von spezifischer DNA zu der BsoBI Variante A153C verursacht dabei eine Abnahme des FRET-Effekts. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass sich beim Binden der spezifischen DNA die Fluorophore an Position 153 voneinander entfernen. Bei der BsoBI Variante E100C ändert sich der FRET-Effekt durch Zugabe spezifischer DNA nicht; dies deutet darauf hin, dass in diesem Bereich keine Konformationsänderung stattfindet. Die steady-state FRET-Experimente machen auch den Einfluss der zweiwertigen Metallionen Ca2+ und Mg2+ auf die Konformation der katalytischen Domäne deutlich. Ca2+ induziert eine Konformationsänderung der katalytischen Domäne, so dass sich die Fluorophore an Position 153 näher kommen. Die Zugabe von Mg2+ hat keinen Effekt auf die Konformation von BsoBI.
Die Konformationsänderung bei der Substratbindung und Spaltung, wie auch der Einfluss der Metallionen, wurden darüber hinaus mittels pre-steady-state Experimenten untersucht, bei denen doppelt markiertes Protein und unmarkierte DNA oder aber markierte DNA und einfach markierte BsoBI Varianten eingesetzt wurden. Diese Experimente bestätigen den beobachteten Einfluss der DNA-Bindung auf die Konformation der katalytischen Domäne. Des Weiteren konnte mit Hilfe des entwickelten kinetischen Models der DNA-Bindung und Spaltung das Vorliegen von mindestens zwei Konformationen des freien Enzyms aufgedeckt werden. Eine dieser Konformationen wurde als kompetent, die andere als inkompetent für die Substratbindung eingestuft. Die Ergebnisse der pre-steady-state Experimente zeigen auch, dass die zweiwertigen Metallionen Ca2+ und Mg2+ mit unterschiedlicher Affinität gebunden werden, dabei bindet Ca2+ im Vergleich zu Mg2+ fester und schneller.
Anschließende fluoreszenzspektroskopische Einzelmolekülmessungen bestätigten schließlich die Existenz von zwei unterschiedlichen Konformationen des BsoBI Apoenzyms und ermöglichten weiterhin, die relative Größe der beiden Subpopulationen zu quantifizieren. Ferner konnten die Einzelmolekülmessungen mehr als eine Konformation und somit unterschiedliche Bindungsmodi nachweisen, wenn BsoBI an unspezifische DNA bindet.
Durch die Kombination unterschiedlicher fluoreszenzspektroskopischer Techniken und die gezielte Auswahl geeigneter modifizierter BsoBI Varianten war es so möglich, die Konformationsdynamik bei der Bindung und Spaltung der Substrat-DNA von BsoBI aufzuklären und zu modellieren. Dabei waren vor allem die Richtung der Konformationsänderung bei der DNA-Bindung sowie der Einfluss der Metallionen auf die Konformation überraschend.