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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-72195
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2009/7219/


Bestimmung Hepatitis C-Virus-spezifischer CD4/CD8 T-Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie

Determination of hepatitis C virus-specific CD4/CD8 T-lymphocytes using flow cytometry

Leutz, Anke


pdf-Format: Dokument 1.pdf (1.639 KB)

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SWD-Schlagwörter: Lymphozyt , Durchflusscytometrie , Hepatitis C , Hepatitis-C-Virus , Killerzelle , T-Lymphozyt , FACS , Helferzelle
Freie Schlagwörter (Deutsch): Pseudotypen
Freie Schlagwörter (Englisch): lymphocyte , T-lymphocyte , cytotoxic , flow cytometry , hepatitis C , hepatitis C-virus , HCV pseudotyped particles
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Virologie ; Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main, Institut für Medizinische Virologie
Fachgebiet 1: Veterinärmedizin
Fachgebiet 2: Externe Einrichtungen
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 12.10.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Das Hepatitis C-Virus ist eines der am weitesten verbreiteten persistierenden humanen Viren, mit dem weltweit über 170 Millionen Menschen chronisch infiziert sind. Bei über 80 Prozent der infizierten Personen kommt es zu einer chronischen Infektion, 20 bis 30 Prozent der Patienten erkranken an Leberzirrhose und bei 2,5 Prozent treten hepatozelluläre Karzinome auf. Gegenwärtig existiert keine Impfung gegen HCV, die derzeitige antivirale Therapie ist mit starken Nebenwirkungen verbunden, und überhaupt nur bei 50-60 Prozent der behandelten Patienten erfolgreich. Zudem stellen die Folgen einer Infektion mit HCV heute in den USA und Europa die vorherrschende Ursache für die Notwendigkeit einer Lebertransplantation dar.
Es ist anzunehmen, dass im Verlauf einer Infektion mit dem Hepatitis C-Virus der zellulären Immunantwort eine Schlüsselrolle zukommt. Ziel dieser Arbeit war es, ein Testsystem zu etablieren, mit dessen Hilfe HCV-spezifische T-Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie gemessen werden können, um so einen Beitrag zum besseren Verständnis für die Immunantwort gegen das Hepatitis C-Virus zu leisten. Das System des Lymphozytenstimulationstestes soll außerdem als Modell für die Messung der Immunantwort gegen weitere Viren dienen, wie das verwandte Klassische Schweinepest-Virus oder das Bovine Virusdiarrhoe/Mucosal Disease (BVD/MD)-Virus. Das bessere Verständnis der zellulären Immunantwort kann zur Entwicklung von Impfstoffen sowie zur Prävention und Therapie einer Erkrankung entscheidend beitragen.
Die vorliegende Arbeit etabliert ein Testsystem zur Messung HCV-spezifischer T-Lymphozyten. Da das Hepatitis C-Virus nur sehr ineffizient in Zellkultur repliziert, gibt es verschiedene Surrogatmodelle, um das Virus und seine Pathogenese genauer zu untersuchen. Vielfach werden verschiedene rekombinante HCV-Proteine eingesetzt, um die Lymphozytenfunktion zu überprüfen. Es bleibt allerdings unklar, inwieweit solche Antigene in vivo tatsächlich den T-Zellen präsentiert werden. Als neues Stimulationsmodell setzt diese Arbeit HCV-Pseudotypen ein. Dabei bestehen die HCVpp aus lentiviralen Core-Partiken, die an ihrer Oberfläche unmodifizierte HCV E1- und E2-Hüllglykoproteine tragen, um so als Pseudotypen das native Hepatitis C-Virus zu imitieren.
Die Verwendung von HCVpp im Lymphozytenstimulationstest führte zu vergleichbaren Ergebnissen wie die Protein-Stimulation, wobei die HCVpp zu einer stärkeren Stimulation der CD4-Lymphozyten führten. Falls sich diese Überlegenheit der HCVpp in weiteren Studien bestätigen würde, wäre dies ein großer Vorteil gegenüber der herkömmlichen Stimulation mit HCV-Proteinen, da die CD4-Lymphozyten eine entscheidende Rolle im Verlauf der HCV-Infektion spielen.
Die Auswertung der Patientendaten ergab eine Th2-Verschiebung der Lymphozytenantwort bei denjenigen Patienten, die das Virus nicht beseitigen konnten. Zudem lassen die Ergebnisse vermuten, dass eine antivirale Therapie zu einer Rekonstitution oder Entwicklung einer Th1-Antwort und damit zur erfolgreichen Überwindung der HCV-Infektion führen könnte. Warum bei einigen Patienten die Therapie jedoch versagt, bleibt in weiteren Studien zu klären.
Kurzfassung auf Englisch: The hepatitis C virus is one of the most prevalent persistent human viruses, more than 170 million humans worldwide are chronically infected. In more than 80 percent of infected persons the infection causes chronicity, which leads in 20 to 30 percent of patients to cirrhosis of the liver and in 2.5 percent to hepatocellular carcinoma. There is still no vaccine against HCV, the current antiviral therapy has strong side effects, and the treatment is successful in only 50 to 60 percent of patients. An infection with HCV is the leading cause for liver transplantation in the United States and Europe.
The cellular immune response is supposed to play an important role in the course of infection with the HCV. The objective of this work was to establish a test system for the analysis of HCV-specific T lymphocytes by flow cytometry to achieve a better understanding of the immune response against the hepatitis C virus. In addition, the system could serve as a model for analysing the immune response against other viruses such as the related Classical Swine Fever Virus or Bovine Virus Diarrhea/Mucosal Disease (BVD/MD) Virus. The enhanced understanding of the cellular immune response can support the development of vaccines as well as be helpful for the prevention and treatment of illness.
In this study, a test system for the analysis of HCV-specific T lymphocytes could be established. Given that the hepatitis C virus replicates very insufficiently in a cell culture, there are several surrogate markers for the virus and its pathogenesis. Different recombinant HCV proteins are used for the investigation of lymphocyte function. But it still remains unclear, how such antigens are presented to the T cells in vivo. In this study, HCV pseudoparticles (HCVpp) are used as a new model for the specific stimulation of T cells. The HCVpp consist of lentiviral core particles which are carrying unmodified HCV E1 and E2 glycoproteins on their surface. This pseudoparticles mimic the native hepatitis C virus.
The use of HCVpp for the stimulation of antigen specific T lymphocytes led to similar results in comparison to the stimulation with HCV proteins. Notably, in CD4+ lymphocytes the stimulation with HCVpp resulted in stronger cytokine responses. As CD4+ lymphocytes play a crucial role in the course of HCV infections, this superiority of the HCVpp is a big advantage over conventional stimulation approaches with HCV proteins. However, these enhanced stimulation properties remain to be confirmed in further studies.
The analysis of patient data showed a shift to Th2 response for those patients who could not eliminate the virus. Moreover, the results suggest that the antiviral therapy leads to a reconstitution or development of a Th1 response, and thus a successful resolution of HCV infection could result. The reason for therapy failure in some patients remains to be scrutinized in further studies.