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URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2009/7056/


Untersuchungen zur Immunogenität verschiedener äußerer Membranproteine von Brachyspira hyodysenteriae im Zellkultur-Adhärenz-Modell

Richter, Maike


Originalveröffentlichung: (2009) Giessen : VVB Laufersweiler 2009
pdf-Format: Dokument 1.pdf (4.998 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5419-9
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.04.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 06.07.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Die Schweinedysenterie ist eine durch Brachyspira (B.) hyodysenteriae verursachte mukohämorrhagische Diarrhö, die weltweit große wirtschaftliche Bedeutung besitzt. Habitat des Erregers ist der Dickdarm. Hilfestellung für die dauerhafte Besiedlung dieses Darmabschnitts könnte von Erreger-Wirtszell-Interaktionen ausgehen, die sich bei in vitro Versuchen in einer Adhärenz der Brachyspiren an Epithelzellen darstellen. Vermittler dieser Adhärenz sind nach ihrer exponierten Lage in der Zellwand der Bakterien zu urteilen äußere Membranproteine (OMP) der Brachyspiren. Diese Hypothese war Ausgangspunkt der vorliegenden Arbeit. Es war zu beantworten, ob Brachyspiren an Säugerzellkulturen, insbesondere an Darmepithelzellen vom Schwein, adhärieren und ob Antikörper gegen OMPs von B. hyodysenteriae diese Adhärenz inhibieren können. Weiterhin sollte an Untersuchungen mit verschiedenen Serotypen von B. hyodysenteriae geklärt werden, ob die verwendeten OMPs serologisch einheitlich sind und ob die Inhibierung der Anheftung als serotypübergreifend oder eher als serotypspezifisch zu charakterisieren ist.
Die OMPs von B. hyodysenteriae Stamm B204 mit den Bezeichnungen Bhlp16, Bhlp29,7d, Bhmp39f und Bhmp39h wurden in E. coli BLR(DE3) kloniert und nach Expression affinitätschromatographisch gereinigt. Zur Herstellung rOMP-spezifischer Antiseren (Anti-rOMP) wurden Kaninchen in Intervallen von jeweils 1-2 Wochen zweimalig subkutan und dreimalig intravenös immunisiert. Die 1 Woche nach der letzten Antigenapplikation gewonnenen Seren wurden mittels SDS-PAGE und Immunoblot auf Reaktivität gegenüber den rOMPs und den entsprechenden Proteinen in den Ganzzelllysaten der Serotyp-Referenzstämme geprüft. Versuche zur Prüfung der Inhibition der Adhäsion der verschiedenen B. hyodysenteriae Serotypen erfolgten im Zellkulturadhärenzmodell (s. u.). Zur Prüfung der Adhärenz der Brachyspiren an Kulturzellen dienten verschiedene Darmepithelzelllinien wie IEC-18- (Ratte), IPEC-J2- (Schwein) und HRT-18-Zellen (Mensch). Vermehrungsfähige Brachyspiren in Nährbouillon wurden auf den mit BHI gewaschenen Zellrasen pipettiert und nach zweistündiger Inkubation und dreimaliger Waschung mit PBS die an den Zellen haftenden Bakterien durch Immunfluoreszenzfärbung detektiert und quantifiziert. Adhärenzhemmversuche erfolgten nach vorhergehender 20 minütiger Inkubation der Brachyspirensuspension mit dem fraglichen Antiserum, bzw. einer Ultraschallpräparation aus Kulturzellen in analoger Weise.
Die mit den verschiedenen rOMPs immunisierten Kaninchen bildeten jeweils spätestens nach dreimaliger Antigenapplikation im Immunoblot detektierbare Antikörper gegen die verwendeten Antigene. Bis auf Bhlp16 bei Stamm B8044, der nach eigenen molekularbiologischen Untersuchungen nicht über das entsprechende Protein verfügte, erkannten die Antiseren Proteine im jeweils erwartenden Größenbereich in Ganzzelllysaten aller 9 Serotyp-Referenzstämme.
Im Rahmen der zellbiologischen Experimente adhärierten die Brachyspiren sowohl an IEC-18- als auch an IPEC-J2-Zellen, nicht jedoch an die humanen HRT-18-Zellen. Die Adhäsion war sowohl durch Serum von rekonvaleszenten Schweinen, als auch durch Ultraschalllysate entsprechender Zellen hemmbar. Die Verwendung der rOMP-spezifischen Antiseren reduzierte im Zellkulturadhärenzmodell mit IPEC-J2-Zellen die Adhäsion des Spenderstamms in unterschiedlichem Ausmaß. Bei Prüfung aller möglichen Serumkombinationen wiesen jene die höchsten Hemmeffekte auf, die Anti-rBhlp16 und Anti-rBhmp39f enthielten. Unter Verwendung einer Mischung aus diesen beiden Antiseren war eine Inhibition der Adhäsion von allen 9 B. hyodysenteriae Serotypen möglich. Die Adhäsionsreduktion reichte von 53 % bis 91 %.
Aus den Versuchen der vorliegenden Arbeit wird abgeleitet, dass B. hyodysenteriae-Stämme spezifisch an animale Darmepithelzelllen adhärieren können und dass an dieser Adhärenz äußere Membranproteine (OMP) von B. hyodysenteriae mitbeteiligt sind. Die untersuchten OMPs erwiesen sich als serologisch einheitlich. Gleichzeitig waren Antikörper gegen diese OMPs in der Lage, die Adhärenz der Bakterien an die Zellkulturen serotypübergreifend zu inhibieren. Nach aller Wahrscheinlichkeit wird die Adhärenz aber nicht nur von einem Protein vermittelt. Sie ist eher als Folge der additiven Wirkung mehrerer Proteine anzusehen. Hierbei haben Bhlp16 und Bhmp39f nach den vorliegenden Untersuchungen jedoch einen besonderen Anteil.

Kurzfassung auf Englisch: The spirochete Brachyspira (B.) hyodysenteriae is the causative agent of swine dysentery, a mucohaemorrhagic diarrhoeal disease of great commercial relevance and worldwide occurrence. The bacterium colonises the large intestine which could probably be promoted by interactions between host cell and causative agent. The potency of B. hyodysenteriae to adhere to epithelial cells was shown in cell culture experiments. Localised on the surface of the bacterial cell wall, outer membrane proteins (OMPs) may be implicated in mediating this phenomenon. In order to test this hypothesis the aim of this thesis was to investigate whether Brachyspira are really able to adhere to mammalian cells, in particular swine intestine epithelial cells, and if antibodies against OMPs of B. hyodysenteriae can inhibit adhesion. Furthermore, it was determined whether OMPs are serologically consistent and whether inhibition of pathogen adhesion is serotype dependent or rather serotype independent.
The OMPs Bhlp16, Bhlp29,7d, Bhmp39f and Bhmp39h of B. hyodysenteriae strain B204 were cloned into E. coli BLR(DE3), expressed and affinity purified via chromatography. The rOMP-specific antisera (Anti-rOMP) were raised in rabbits by vaccinating them twice subcutaneously, followed by three intravenous boosters in intervals of one to two weeks. The sera, raised one week after the last immunisation, were tested for their reactivity against rOMPs and the corresponding proteins present in whole cell lysates isolated from serotype-reference-strains, using SDS-PAGE and western blot. Experiments aiming to assess the inhibition of the bacterial adhesion of the different serotypes of B. hyodysenteriae were performed in a cell culture-adherence model. The adherence capacity of B. hyodysenteriae to different intestinal epithelial cell lines, i.e. IEC-18- (rat), IPEC-J2- (swine) and HRT-18-cells (human) was determined. Viable brachyspira cultured in bouillon were inoculated to cell layers (washed with BHI). Adherent bacteria were detected and quantified using indirect immunofluorescence after an incubation time of two hours and three washing steps with PBS. Adherence inhibition tests were performed after preincubating (20 minutes) the brachyspira with the antiserum in question or a whole cell sonicate of cell culture cells.
All of the rabbits immunised with the different rOMPs, produced antibodies against the used antigens (detectable via immunoblot; latest after the third vaccination). Apart from Bhlp16, which was not encoded by the reference strain B8044 (PCR-result), the produced antisera detected proteins of expected size in the whole cell lysates of all 9 serotype-reference-strains.
In the cell culture-adherence model, brachyspira adhered to IEC-18-cells as well as to IPEC-J2-cells, but not to the human HRT-18-cells. Adherence could be inhibited using sera of reconvalescent pigs as well as whole cell sonicates of the corresponding cell cultures. The application of the rOMP-specific antisera reduced the adhesion of the donor-strain to the IPEC-J2-cells in different degrees. When testing different combinations of antisera, those containing Anti-rBhlp16 and Anti-rBhmp39f showed the highest inhibition effects. Using a mixture of both antisera, inhibition of adhesion of all 9 serotypes was possible. The reduction of adhesion ranged from 53 % to 91 % in comparison to the negative controls.
In conclusion, the results demonstrate that B. hyodysenteriae strains can adhere specifically to animal intestinal epithelial cells and that outer membrane proteins (OMPs) of B. hyodysenteriae are involved in this process. The investigated OMPs proved to be serological consistent. Furthermore, antibodies against these OMPs were able to inhibit bacterial adhesion of all brachyspira serotypes to cultured IPEC-J2-cells. It seems likely that the adherence is mediated not only from one OMP alone, but is the result of the additive action of different OMPs. The studies revealed that both Bhlp16 und Bhmp39f obviously play an important role in mediating this process.