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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-69557
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2009/6955/


Untersuchung genetischer Ursachen der unterschiedlichen Empfänglichkeit für die Paratuberkulose des Rindes anhand von Mikrosatelliten- und Kandidatengenanalysen

Hinger, Michaela


Originalveröffentlichung: (2009) Giessen : VVB Laufersweiler
pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.178 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Tierzucht und Haustiergenetik
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5397-0
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.02.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 27.04.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel der Arbeit war die Charakterisierung von genetischen und umweltbedingten Einflüssen auf die Paratuberkulose des Rindes. Durch molekulargenetische sowie statistische Untersuchungen sollten genetische Prädispositionen für die Infektion mit Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) beim Milchrind analysiert werden.

Zunächst erfolgte die Schätzung von Heritabilitäten für die Antikörperantwort gegenüber der MAP-Infektion anhand eines erstellten Datenmaterials aus Thüringen, das 4524 Dt. Holstein Kühe aus 12 Betrieben einschließlich ihrer Pedigree- und Leistungsdaten umfasste. Zugrunde lagen den Schätzungen die serologischen Ergebnisse aus dem ersten Halbjahr 2005, wobei 14,1 % der Tiere positiv, 17,1 % verdächtig und 68,8 % negativ auf Antikörper gegen MAP getestet worden waren. Basierend auf der trichotomisierten Einstufung in positive, verdächtige und negative Tiere und die Zuteilung der verdächtigen Rinder zu jeweils einer der Gruppen bzw. auf den Messwerten des ELISA-Verfahrens lagen die geschätzten Heritabilitäten zwischen 0,05 und 0,14.

Weiterhin wurde durch molekulargenetische Untersuchungen auf der Basis von Kandidatengen- und Mikrosatellitenuntersuchungen die genetische Prädisposition für die Infektion mit Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) bei Dt. Holstein analysiert. Um eine Assoziation zwischen ausgewählten Mikrosatelliten bzw. Kandidatengenen aus den verschiedenen immunologischen Kaskaden und dem MAP-Status zu ermitteln, wurde das Design einer Fall-Kontroll-Studie gewählt.

Zu diesem Zweck wurde eine aus n = 594 Tieren bestehende Fallgruppe erstellt. Die Kontrollgruppe bestand aus 585 Tieren, die aus demselben Betrieb stammten wie das betroffene Tier, im entsprechenden Alter (± 3 Monate) und möglichst väterliche Halbgeschwister waren. War kein gleichaltriges Tier vorhanden, wurde ein älteres Tier als Kontrolltier gewählt.

Die Kandidatengene Natural Resistance associated Macrophage Protein 1 (NRAMP1), Toll-like Receptor 4 (TLR4), Caspase Recruitment Domain Family, Member 15 (CARD15) und GATA-binding Protein 3 (GATA3) wurden zunächst durch PCR-Direktsequenzierung in verschiedenen Rinderrassen auf Polymorphismen untersucht, Typisierungsmethoden etabliert und anschließend die MAP-Test-positiven und -Test-negativen Tiere genotypisiert. Die Proben wurden weiterhin auf Polymorphismen im Kandidatengen Interleukin 2 (IL2) mit bereits etablierten Methoden analysiert.

Die PCR-Amplifikation der Mikrosatelliten BB717, BB705, BB704, BMC9006, BB719, BMS1617, BB702, BOBT24, RM106 und BM1225 erfolgte mittels fluoreszenzmarkierter Primer in Multiplex-Ansätzen, danach erfolgte die Genotypisierung am ABI PRISM® 377 DNA Sequencer.

Die durchgeführten Assoziationsstudien zeigten sowohl in den Mikrosatelliten als auch in den Kandidatengenen NRAMP1, TLR4, IL2 und GATA3 keine signifikanten Unterschiede in den Allelfrequenzen zwischen der Fall- und Kontrollgruppe. Beim Kandidatengen CARD15 konnte eine statistisch signifikante Assoziation (p < 0,05) der Allelfrequenzen des Basenaustausches E4+921 g>a mit dem Infektionsstatus der untersuchten Kühe festgestellt werden. Tiere, die an dieser Position homozygot für das Allel "a" waren, traten nur in der positiven, nicht jedoch in der Kontrollgruppe auf. Dieser Unterschied war in den Genotypfrequenzen nicht statistisch abzusichern. Demnach liegt voraussichtlich eine Kopplung dieses Basenaustausches mit einem funktionellen SNP vor. Es obliegt weiteren Forschungsarbeiten, die tatsächliche funktionelle Bedeutung und eventuelle Korrelationen des SNP CARD15 E4+921 mit Merkmalen, die einer Anwendung im Sinne einer markergestützten Selektion entgegenstünden, zu prüfen.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of this study was to characterize genetic and environmental factors on paratuberculosis (Johne’s disease) in cattle.

Molecular genetics and statistical analyses were applied to examine the genetic predisposition to Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) infection in dairy cattle. First, heritability estimates for antibody response to MAP infection in German Holstein were calculated. Pedigree data, performance data and blood samples from 4,524 cows originating from 12 farms were collected in Thuringia.

Heritability estimates were based on serological results, ascertained in spring 2005. Of the animals tested, 14.1 % were positive, 17.1 % questionable and 68.8 % negative for serum antibodies to MAP. Based on this trichotomised classification (positive, questionable and negative) and the designation of questionable cows to either the negative or positive group, and in a second model based on ELISA OD-values, estimated heritabilities varied from 0.05 to 0.14.

Furthermore, the aim of this study was to analyse possible associations of microsatellites located near or within candidate genes involved in immune response to mycobacteria and of particular candidate genes with susceptibility to MAP in cattle. A case control study was chosen to determine the association between selected microsatellites and candidate genes, respectively, and MAP status of the animals.

For these purposes, a case panel of 594 MAP positive animals was composed. The control group comprised 585 animals testing negative for MAP, each of which correlated in age at the time of testing, descended from the same sire and originated from the same farm as each of the positive animals. If no matching half-sib was present in the population, preferably older animals born on the same farm and with repeated negative test results were chosen as controls.

To detect polymorphisms, the candidate genes natural resistance associated macrophage protein 1 (NRAMP1), toll-like receptor 4 (TLR4), caspase recruitment domain family, member 15 (CARD15) und GATA-binding protein 3 (GATA3) were sequenced in different cattle breeds. Screening methods for polymorphisms were established and the case and control groups were investigated, respectively. The samples were also tested for polymorphisms in the candidate gene IL2 with previously established molecular methods.

Microsatellite loci were co-amplified in three groups using fluorescent labelled primers: BB704, BB705, BB717, BB719 and BMC9006 (Multiplex 1) and BMS1617, BB702 and BOBT24 (Multiplex 2) as well as RM106 and BM1225 (Multiplex 3). Fragment analysis was performed using the ABI PRISM® 377 DNA Sequencer.

Association studies did not reveal significant differences in allele frequencies between the case and control groups. This was the case for all microsatellites and for the candidate genes NRAMP1, TLR4, IL2 and GATA3. In the candidate gene CARD15, a statistically significant association (p < 0.05) of SNP E4+921 g>a allele frequencies with MAP infection status of investigated cows could be determined.
Animals homozygous for allele "a" on this position were only detectable in the positive group, not in the control panel. This difference in genotype frequencies could not be ensured with statistic methods. According to these results, a linkage of this SNP with a functional variant is probable.

Additional research work is necessary to investigate the relevance and potential correlation of SNP CARD15 E4+921 with traits that would allow implementation in marker assisted selection.