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Role of impaired lysosomal trafficking in the development of lung fibrosis in a murine model of Hermansky-Pudlak syndrome

Untersuchungen zur Rolle gestörter lysosomaler Transport Prozesse bei der Entwicklung einer Lungenfibrose in einem Mausmodell des Hermansky-Pudlak Syndroms

Mahavadi, Poornima


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Freie Schlagwörter (Englisch): surfactant , lysosome , lamellar bodies
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Medizinische Klinik II
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.04.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 16.04.2009
Kurzfassung auf Englisch: Hermansky-Pudlak syndrome (HPS) comprises of a group of rare hereditary
disorders primarily affecting transport within lysosome related organelles. Up to
now, 16 (mice) and 8 (human) genes, respectively, have been found to cause
this disease. Amongst other clinical symptoms, patients with HPS may develop
lung fibrosis (HPS associated Interstitial Pneumonia; HPSIP). As a consequence
of such organ involvement, quality of life is then greatly reduced and prognosis is
poor. The underlying molecular reasons for the development of HPSIP had yet
not been settled. However, on an ultrastructural level, patients with HPSIP
impose with an abnormal enlargement and increased number of lamellar bodies,
a lysosome related organelle of alveolar type II cells (AECII) that represents the
intracellular storage and secretion form of pulmonary surfactant.

Drawn against this background, the genotype-phenotype correlation was
analyzed in mice with different single and combined HPS mutations. This work
primarily focussed on the extent of pulmonary fibrosis and performed an in depth
surfactant analysis in the lungs of HPS1, HPS2, HPS6, HPS1/6, HPS1/2 and
respective wild type mice. In addition, altered signalling pathways and cellular
consequences were studied.

Histological studies, undertaken after 3 and 9 months of age, revealed that only
HPS1/2 mice, but none of the other HPS mice, would develop lung fibrosis, being
quite extensive by 9 months of age. In these mice, but in none of the other mice,
AECII appeared swollen and seemed to contain more and larger lamellar bodies.
On the other hand, especially the HPS1/6 mice revealed spontaneous
development of airspace enlargement. Defective intracellular surfactant
trafficking and secretion was a prominent finding in HPS 1/2 mice and caused a
highly significant intracellular accumulation of the mature hydrophobic surfactant
proteins SP-B and SP-C as well as phospholipids. Among the phospholipids,
especially the dipalmitoylated phosphatidylcholine (DPPC), the most abundant
surfactant compound, was significantly elevated in lung tissues of HPS 1/2 mice.
Isolated AECII from these mice revealed similar results. In contrast, although
these above mentioned surfactant compounds appeared slightly increased in the
mono mutant and the HPS 1/6 mice, there was a significant difference between
HPS1/2 on the one, and the other mice on the other hand with regard to the
extent of disturbed intracellular transport and accumulation of surfactant
compounds.

As a possible consequence of such defective transport and secretion of
surfactant, AECII apoptosis was observed extensively in 3 and 9 month old
HPS1/2 mice by in-situ apoptosis assay and by immunohistochemistry of cleaved
caspase 3. Hypothesizing that apoptosis of AECII in HPS1/2 mice would develop
due to severe cellular stress, lysosomal and ER stress markers in these mice
were investigated. The lysosomal protease, cathepsin D, was highly elevated in
lung homogenates and isolated AECII of HPS1/2 mice, but, again, in none of the
other mutant mice. Such increase in cathepsin D was already visible at the age
of 3months. These results indicate an early onset lysosomal stress specifically in
HPS1/2 mice. Apart from this, HPS 1/2 mice also exhibited signs of severe ER
stress at a later age (9 months). In detail, CHOP, a proapoptotic factor
specifically induced by unresolved ER-stress, was found to be highly and
exclusively elevated HPS1/2 mice. In addition, lipidomic profiling of 9 month old
lung tissues from all HPS mice revealed increased levels of glucosylceramides
only in HPS1/2 mice, which also hints towards a serious cellular stress in these
mice.

Data from the HPS1/2 mouse model was aptly supported by those obtained from
HSPIP patients. As compared to lung transplant donor lungs, paraffin sections of
lungs from two HPSIP patients (HPS1 mutation) showed a highly increased
immunostaining for cathepsin D in AECII, alongside with induction of caspase-3
and CHOP immunostaining in this cell-type, thereby confirming the cellular stress
mechanisms as observed in HPS1/2 mice.

Taken together, this is the the first time to decipher HPS1/2 mice as a valuable
animal model of human HPSIP. With regard to the clinical similarities and
common pathomechanistic principles between HPSIP and patients with
Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF), HPS 1/2 mice also offer as the currently best
available model of IPF. This study showed that defective intracellular surfactant
trafficking in AECII of these mice leads to the development of lysosomal and ER
stress, finally resulting in AECII apoptosis, and – at the end - development of
lung fibrosis. Analysis of markers of lysosomal and ER-stress in human HPSIP
samples fully corroborated such pathomechanistic concept and lends further
credit to the general concept that apoptosis of the AECII represents a key step in
the development of lung fibrosis in non-inflammatory triggered forms of Interstitial
Lung Diseases. On the basis of these results, further elucidation of the molecular
mode of action and the binding partners of the concerned HPS gene products
(adaptor protein 3 and BLOC 3) appears reasonable and therapeutic strategies
aiming to either restore the defective transport mechanism or to block the cellular
stress response or AECII apoptosis are warranted.
Kurzfassung auf Deutsch: Das Hermansky-Pudlak syndrom (HPS) umfasst eine Reihe seltener und
vererbbarer Erkrankungen, die primär alle zu einer Beeinträchtigung lysosomaler
Transportprozesse führen und klinisch ein vergleichbares Spektrum an
Beschwerden und Symptomen auslösen. Bis dato sind 16 (Maus) bzw.
(Mensch) verschiedene Gene bekannt, die im Falle einer Mutation die
Erkrankung auslösen können. Neben vielfältigen anderen
krankheitsdefinierenden Symptomen entwickeln viele betroffene Patienten eine
Lungenfibrose (HPS associated Interstitial Pneumonia; HPSIP). In diesem Fall
entwickelt sich eine deutliche Einschränkung der Lebensqualität und die
Prognose der betroffenen Patienten ist schlecht. Die der Entwicklung der HPSIP
zugrunde liegenden Pathomechanismen waren bis dato nicht bekannt, allerdings
wurde in früheren post-mortem Analysen ein auffälliges Erscheinungsbild der
alveolären Typ II Zellen (AECII) beschrieben, mit einer vermehrten Anzahl und
einer Vergrößerung der Lamellarkörperchen, dem lysosomalen Organell der
AECII, in dem pulmonaler Surfactant intrazellulär gespeichert wird.


Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, eine Korrelation
des Genotyps mit dem Phänotyp bei verschiedenen mono- oder doppelt
mutanten HPS Mäusen (HPS 1, 2, 6, 1/2, 1/6) im Vergleich zum genetischen
Hintergrund durchzuführen. Im Fokus stand hierbei zunächst die Frage ob auch
bei murinen HPS Formen eine HPSIP auftritt und welche assoziierten
Veränderungen des Surfactantsystems hierbei beobachtet werden können.
Weiterhin wurden verschiedene zelluläre Stresspfade, wie lysosomaler Stress
oder Endoplasmatisches Retikulum (ER)-Stress, untersucht und mit den anderen
Befunden korreliert.


Die im Alter von 3 und 9 Monaten durchgeführten histologische Untersuchung
ergaben, dass ausschließlich die HPS 1/2 Mäuse eine Lungenfibrose
entwickelten, die mit 3 Monaten noch sehr diskret, mit 9 Monaten aber voll
ausgeprägt war. In diesen HPS 1/2 Mäusen, nicht aber in den anderen HPS
Mäusen und Wildtyp Tieren, konnte auch ein den Patienten mit HPSIP
entsprechendes Erscheinungsbild der AECII beobachtet werden, mit einer
deutlichen Schwellung und einer Zunahme des Gehalts an Lamellarkörperchen.
Die im Anschluß durchgeführte Analyse des pulmonalen Surfactantsystems
ergab sowohl im Lungengewebe als auch in isolierten AECII der HPS 1/2 Mäuse
eine hochsignifikante Störung des intrazellulären Transports von Surfactantkomponenten,
die zu einer intrazellulären Akkumulation der maturen
hydrophoben Surfactant Proteine SP-B und SP-C sowie der Phospholipide
führte. Bzgl. der Phospholipide konnte vor allem eine hochsignifikante
Akkumulation des dipalmitoylierten Phosphatidylcholins (DPPC) in den Lungen
der HPS 1/2 Mäuse beobachtet werden. Obwohl auch in den anderen HPS
Mäusen eine moderate Störung der intrazellulären Surfactanthomöostase
beobachtet werden konnte, war der Unterschied dieser Veränderungen zwischen
den HPS 1/2 und den anderen HPS und den Wildtyp Tieren doch erheblich und
ebenfalls hochsignifikant.


Als mögliche Folge dieses hochgradig gestörten intrazellulären Surfactanttransports
konnte ausschließlich in den HPS 1/2 Mäusen, und zwar bereits im
Alter von 3 Monaten, eine Apoptose der AECII mittels der TUNEL Methode oder
der Immunohistochemie (IHC) für gespaltene Kaspase 3 beobachtet werden. In
den anderen HPS oder Wildtyp Tieren war dies in keinem Fall zu beobachten.
Als zugrunde liegende zelluläre Stressreaktionen konnte zunächst eine Induktion
des Kathepsin D in den AECII der HPS 1/2, nicht aber in den anderen HPS
Mäusen, mittels Western Blot und ICH nachgewiesen werden. Dieser lysosomale
Stressmarker war bereits im Alter von 3 Monaten erhöht. Noch nicht in diesem
Alter, aber dann mit 9 Monaten ebenfalls prominent nachweisbar, war CHOP, ein
proapoptotisch wirksamer Faktor, der infolge eines anhaltenden und nicht
korrigierbaren ER-Stresses entsteht und zwingend mit der Entwicklung der
Apoptose einhergeht Auch dieses Faktor wurde exklusiv in den AECII von HPS
1/2 Mäusen beobachtet. Schließlich fiel im Rahmen von Untersuchungen des
Lipidoms auch noch eine Erhöhung des relativen Anteils von Glukosylceramiden
auf, ebenfalls ein Marker für eine schwerwiegende Stressantwort der Zelle.


Die in den HPS 1/2 Mäusen gewonnenen Daten konnten im Lungengewebe von
zwei Patienten mit HPSIP vollständig reproduziert werden: auch hier fand sich im
Vergleich zum Lungengewebe von Organdonoren eine deutliche Induktion von
Kathepsin D und CHOP in den AECII, die zudem auch größtenteils Zeichen der
stattfindenden Apoptose aufwiesen.


Zusammengefasst konnte mit den HPS 1/2 Mäuse werden ein murines Korrelat
der am Patienten zu beobachtenden HPSIP beschreiben. Aufgrund der
Ähnlichkeiten hinsichtlich des klinischen Beschwerdebildes und der Prognose
dieser Patienten mit Patienten mit einer Idiopathischen Pulmonalen Fibrose
(IPF), stellen HPS 1/2 Mäuse unserer Meinung nach außerdem das derzeit beste
Modell der IPF dar. In diesen HPS 1/2 Mäusen bewirkt der gestörte intrazelluläre
Transport und Sekretion von Surfactantkomponenten einen frühen lysosomalen
Stress, gefolgt von einer späteren ER-Stress, die beide die Apoptose der AECII
und – über noch zu definierende Schritte – die Lungenfibrose auslösen. Die
Analyse von Markern eines lysosomalen und eines ER-Stresses in Patienten mit
HPSIP bestätigen in vollem Umfang dieses pathomechanistische Konzept und
stärken die Annahme, dass die unkontrollierte Apoptose der AECII ein
Schlüsselvorgang bei der Entwicklung nicht-inflammatorisch getriggerter Formen
der Lungenfibrose darstellt. Unsere Untersuchungen befürworten die weitere
Aufdeckung der molekularen Wirkungsweise und intrazellulärer Bindungspartner
der HPS 1/2 Genprodukte (Adaptor Protein 3, BLOC3) in den AECII.
Darüberhinaus erscheint die therapeutische Korrektur des gestörten Surfactant-
Transports wie auch die mögliche Blockade der lysosomalen- oder ER-Stress
Antwort in den AECII als hoffnungsvoller therapeutischer Ansatz der Behandlung
der HPSIP.