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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-69479
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2009/6947/


Funktionelle Analysen von Ribonukleoprotein-Partikeln in humanen Zellkulturen durch siRNA vermittelte Unterdrückung der Genexpression

Functional analysis of ribonucleoprotein particles in cultured human cells using siRNA-mediated suppression of gene expression

Hoßbach, Markus


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Freie Schlagwörter (Deutsch): RNAi , siRNA , Spleißen , Spleißosom , snRNP
Freie Schlagwörter (Englisch): RNAi , siRNA , splicing , spliceosome , snRNP
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.12.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 16.04.2009
Kurzfassung auf Deutsch: RNA-Interferenz (RNAi) ist ein regulatorischer Mechanismus der meisten eukaryotischen Zellen, der kurze doppelsträngige RNA (dsRNA) Moleküle als Trigger zur Sequenzhomologie-abhängigen Kontrolle der Genaktivität nutzt. Diese kleinen dsRNA Moleküle werden als small interfering RNAs (siRNAs) bezeichnet, sind ~21-22 nt lang und besitzen charakteristische 2 nt 3’-Überhänge. Zu Beginn dieser Arbeit wurde in unserem Labor gezeigt, dass in Säugerzellen durch Einschleusen von chemisch synthetisierten siRNAs die Expression einzelner Gene spezifisch unterdrückt werden kann. Diese Methode eröffnete neue Möglichkeiten zur funktionellen Genanalyse.

Im ersten Teil der Arbeit wurde eine siRNA-Selektionssoftware zur Erstellung einer siRNA-Bibliothek entwickelt. Zur Auswahl von siRNAs nach einem alternativen Design-Ansatz wurde eine weitere siRNA-Selektionssoftware entworfen. Diese siRNAs zeichnen sich dadurch aus, dass sie aus zwei partiell komplementären Leit-Strängen mit definierten Ziel-mRNAs bestehen. Die Anwendbarkeit dieser siRNAs wurde experimentell bestätigt. Zur Herstellung der siRNAs für diese Arbeit wurde die chemische RNA-Synthese nach der ACE-Methode in unserem Labor etabliert.

Im zweiten Teil der Arbeit wurden Methoden für einen RNAi-Screen mittleren Durchsatzes zur funktionellen Analyse von RNA-prozessierenden Faktoren entwickelt. Dazu wurden die Auswirkungen des Gen Knockdowns auf die Zellproliferation nach Transfektion von 378 individuellen siRNAs gegen 154 RNA-prozessierende Proteine untersucht. Der Prp 19/CDC5-Komplex gehört zu den nicht-snRNP Komponenten des Spleißosoms und spielt vermutlich eine bedeutende Rolle bei der katalytischen Aktivierung. Einige Proteine dieses Komplexes wurden in weitergehenden Analysen mittels RNAi untersucht. Zunächst wurde die Stärke des erzielten Knockdowns auf mRNA-Ebene validiert. Danach wurde die Anwendbarkeit einer Methode zur Identifizierung von Spleißdefekten untersucht. Als zelluläre Indikatoren für einen Spleißdefekt wurde mit fluoreszenz-mikroskopischen Methoden die Lokalisierung des Proteins SC35, dass als Markerprotein für Spleißosomen enthaltende nukleäre Domänen (sog. Speckles) gilt, der polyA-mRNA und der snRNAs U2, U4 und U5 analysiert. Der Knockdown einiger Gene führte zu deutlichen Phänotypen, die auf einen Spleißdefekt hindeuten.

Im dritten Teil der Arbeit wurden in drei Pilotstudien chemisch synthetisierte siRNAs zur funktionellen Analyse von Ribonukleoprotein-Partikeln eingesetzt: (i) Der U4/U6.U5-tri-snRNP ist eine zentrale Einheit des Spleißosoms und muss nach Abschluß eines Spleißzyklus aus seinen Kompenten neu gebildet werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, wo die U4/U6.U5 tri-snRNP Assemblierung im Kern erfolgt und welche Proteine daran beteiligt sind. Durch Kombination von RNAi und Fluoreszenzmikroskopie konnte in HeLa-Zellen gezeigt werden, dass nach Knockdown des U5-spezifischen Proteins hPrp6 oder des U4/U6-spezifischen Proteins hPrp31 der U4/U6 Recycling-Faktor p110 und Komponenten des U4/U6 di-snRNPs in den Cajal Bodies akkumulieren. Diese Daten zeigten u.a. dass hPrp31 und hPrp6 zwischen U4/U6 und U5 snRNPs auch in vivo eine Brückenfunktion ausbilden, weiterhin bestätigten Zellproliferationsanalysen eine essentielle zelluläre Funktion für diese Proteine. (ii) Neben dem U2-abhängigen Spleißosom existiert ein zweites, das sogenannte U12-abhängige Spleißosom. Dieses ist für das Spleißen von U12-Typ Introns verantwortlich. Zu Beginn dieser Arbeit wurden in unserem Labor neue Komponenten des U12-abhängigen Spleißosom identifiziert. Durch RNAi vermittelten Knockdown und anschließender Proliferationsanalyse konnte für vier dieser U11/U12- bzw. U11-assoziierten Proteine eine essentielle zelluläre Funktion nachgewiesen werden. (iii) snoRNPs (small nukleolar RNPs) bestehen wie snRNPs aus einer RNA-Komponente, der sogenannten snoRNA, und einem Multi-Protein-Komplex. C/D-Box snRNPs sind essentielle Faktoren für die Biogenese von Ribosomen. Die Assemblierung und Reifung der C/D-Box snRNPs erfolgt vermutlich in zwei Phasen, die im Nukleoplasma bzw. in den Cajal-Bodies ablaufen. Der nukleoplasmatische U3 snoRNP enthält neben den Haupt C/D-Box Proteinen weitere nicht-snoRNP Faktoren. Durch RNAi konnte für die meisten dieser Faktoren eine essentielle Funktion für die C/B-Box snoRNP Bildung gezeigt werden. Zellproliferationsanalysen machten deutlich, dass jedes der untersuchten Proteine essentiell für die Aufrechterhaltung des Zellwachstums ist.