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Eine forensische Methode zur Einzelzelluntersuchung mit Sequenzierung des D-Loops der mtDNA

Thias, Verena


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Rechtsmedizin
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.01.2009
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 23.02.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Eine erfolgreiche Analyse von einzelnen Zellen auf ihr DNA-Muster könnte für die forensische DNA-Analyse einen enormen Fortschritt bei der Untersuchung von minimalem Spurenmaterial bedeuten. In der Literatur finden sich Berichte von STR-Typisierungen an Einzelzellen, die jedoch in der forensischen Praxis bisher nicht reproduziert werden konnten. Es existiert aber eine funktionierende Methode zur mtDNA-Sequenzierung an einzelnen Epithelzellen, die es weiter zu verbessern galt, um eine Anwendbarkeit in der forensischen Routine zu erreichen.



Mit Hilfe eines Mikromanipulators wurden Zellen aus Ausstrichen isoliert und in ein Reaktionsgefäß überführt. Die Technik des Single-Cell-Pickings konnte optimiert werden, so dass sie relativ einfach durchzuführen war und die ständige Sichtkontrolle gewährleistet werden konnte. Durch das Hinzunehmen einer Lysereaktion vor der PCR konnte die Quote positiver Ergebnisse erhöht werden. Im Anschluss an die Lyse fanden eine Amplifizierung sowie eine Sequenzierung der mitochondrialen Kontrollregion statt.



Nach erforderlichen Anpassungen in der Versuchsdurchführung wurden schließlich insgesamt 191 Epithelzellen aus Mundschleimhautabstrichen von 6 verschiedenen Probanden untersucht. Aus 57 Zellen wurde eine Amplifizierung der HV1-Region durchgeführt, und bei 73,7% der Proben konnte die Sequenz der jeweiligen Testperson nachgewiesen werden. In der HV2-Region wurden 22 Zellen amplifiziert, von denen 86,4% erfolgreich sequenziert wurden. An weiteren 112 Zellen erfolgte eine Koamplifizierung von HV1- und HV2-Region in einem Ansatz, eine Methode, die bisher noch nicht mit Erfolg an Einzelzellen durchgeführt werden konnte. Die richtige Sequenz wurde bei 67,0% der Proben in der HV1-Region nachgewiesen, für die HV2-Region lag die Quote bei 57,1%.



Auch die Gewinnung und Sequenzierung von Epithelzellen, die sich auf einer Zigarettenkippe befanden, war möglich. Ebenfalls auf einer Zigarettenkippe wurde eine artifizielle Mischspur von zwei Probanden durch gemeinsames Rauchen erzeugt. Nach einer Koamplifizierung an 24 isolierten Einzelzellen konnten in der HV1-Region 20 Zellen positiv sequenziert werden, wobei eine Differenzierung zwischen den beiden Probanden möglich war. Für die HV2-Region gelang nur der Nachweis des einen Probanden an 15 Proben.



Zusammenfassend wurde gezeigt, dass eine mtDNA-Sequenzierung an einzelnen Epithelzellen mit einer hohen Erfolgsquote durchgeführt werden kann. Auch eine Koamplifizierung von HV1- und HV2-Region ist an Einzelzellen möglich. Forensisches Spurenmaterial wie eine Zigarettenkippe ist genauso wie eine Mischspur für eine Analyse mit dem vorgestellten Verfahren geeignet. Erweiterungen könnten sich durch den Einsatz eines hochauflösenden Stereomikroskops ergeben, mit dessen Hilfe Zellen direkt vom Spurenträger gewonnen werden können. Die präsentierte Methode könnte in der forensischen Routine Anwendung finden, wenn eine STR-Analyse oder konventionelle mtDNA-Sequenzierung kein Ergebnis lieferte. Das könnte vor allem bei minimalem oder degradiertem Spurenmaterial sowie Mischspuren der Fall sein. Weiterhin ließe sich das Phänomen der Heteroplasmie näher untersuchen, was die Berechnung von Identitätswahrscheinlichkeiten präzisieren könnte.
Kurzfassung auf Englisch: A successful analysis of single-cell DNA-samples could be a major advance for the investigation of minimal trace-material in forensic DNA-analysis. In literature there are reports on STR-typing of single cells, which could not be reproduced in forensic casework yet. There is already an efficient method for mtDNA-sequencing of single epithelial cells, which had to be improved in order to achieve an applicability in forensic casework.



With the help of a micromanipulator cells from a smear were isolated and transferred to a reaction-tube. The procedure of Single-Cell-picking was successfully optimised, so that it could be carried out easily and a permanent visual control was guaranteed. By adding a lysis before PCR, the rate of positive results was increased. The lysis was followed by an amplification and a sequencing of the mitochondril control region.



After some required adjustments in the practical application of the experiments, a total of 191 epithelial cells from buccal cell-smears of 6 different test persons were analysed. There was an amplification of the HV1-region out of 57 cells, and the sequence of the particular test person could be verified in 73,7% of the samples. Amplification of the HV2-region was performed on 22 cells, out of which 86,4% were successfully sequenced. For another 112 cells there was a combined amplification of the HV1- and the HV2-region in one PCR-batch, a method which could not be implemented with success for epithelial cells before. The correct sequence was verified in 67,0% of the samples for the HV1-region, the rate for the HV2-region was 57,1%.



The isolation and sequencing of epithelial cells, which were located on a cigarette butt, were possible, too. On another cigarette butt an artificial mixed trace of two test persons was generated by shared smoking as well. After a coamplification of 24 isolated single cells, 20 cells could be sequenced correctly in the HV1-region, in which a discrimination between the two test persons was possible. For the HV2- region, a verification could only be achieved for one of the persons in 15 of the samples.



Recapitulating it can be stated, that mtDNA-sequencing of single epithelial cells can be performed with a high success rate. Also a coamplification of HV1- and HV2-region is possible for single cells. Forensic trace material like cigarette butts are just as appropriate for an analysis with the presented method as a mixed trace. Extensions could result from the use of a high-resolution stereomicroscope, which allowes the isolation of cells directly from the trace material. The presented method could find application in forensic casework, in case a STR-analysis or conventional mtDNA-sequencing did not provide results. This could particularly be the case for minimal or degraded trace material and mixed traces. Furthermore the phenomenon of heteroplasmy could be examined more closely, what could bring more precision to the calculation of identity probability.