4. Anschließend wurde eine transiente Transfektion des Response-Plasmids pTRUE-IL-2 in BHK-Tet-on-Zellen durchgeführt und die Aktivität des Reportergens überprüft. Hierbei konnte nach der Induktion des Tet-on-Systems mit Doxyzyklin eine um etwa das Tausendfache gesteigerte Aktivität der Luciferase gemessen werden.
5. Nach der stabilen Transfektion von pTRUE-IL-2 in BHK-Tet-on-Zellen wurden 12 Klone auf die Expression von Luciferase untersucht. 11 davon zeigten eine Induzierbarkeit mit Stimulationsindizes von 2,6 bis 46,8. Bei einer Klon-Linie (A11)wurde ein inverses Verhalten festgestellt. Sie wies induziert eine geringere Luciferase-Expression auf als im nicht induzierten Versuchsansatz. Der zugrunde liegende Mechanismus bleibt allerdings unklar. Weitere Luciferase-Assays auch von reklonierten BHK-Linien bestätigten die Induzierbarkeit des Tet-on-Systems nach der stabilen Transfektion. Die Existenz der mRNA für cIL-2 in den transfizierten BHKKlonen wurde anschließend in einer RT-PCR nachgewiesen.
6. Weiterhin wurde überprüft, ob nicht-transfizierte, native BHK-Zellen eventuell Faktoren abgeben, die die Aktivität von Effektorzellen mit spontaner zytotoxischer Aktivität stimulieren oder blockieren. Dazu wurden Lymphozyten unter Anreicherung von NK-Zellen aus Hundeblut über einen 57,5 %igen Percoll®-Gradienten isoliert, in den Überständen von nativen BHK-Zellen inkubiert und ihre zytotoxische Aktivität in einem kolorimetrischen Farbstofftest, dem Rose Bengal Assay (RBA), gemessen. Durch die Behandlung mit diesen Überständen war keine Veränderung der zytotoxischen Aktivität nachweisbar.
7. Für den Nachweis der biologischen Aktivität des von den transfizierten BHK-Zellen sezernierten cIL-2 wurden Bioassays mit der IL-2-sensitiven Zelllinie CTLL-2 durchgeführt. Bei allen untersuchten BHK-Klonen war eine Produktion von biologisch aktivem cIL-2 nachweisbar. Die Menge des im induzierten Zustand sezernierten cIL-2 ließ sich jedoch schwer bestimmen, da die cIL-2-Produktion je nach Kulturbedingungen (Inkubationsdauer, Zellkonzentration der eingesetzten Klone) stark schwankte. Bei allen Klonen war eine basale cIL-2-Sekretion im nicht induzierten Zustand nachweisbar.
Unter serumfreien Bedingungen ließ sich die Produktion von cIL-2 durch die Zugabe von Doxyzyklin nicht induzieren. Unterschiedliche induzierende Doxyzyklin-Konzentrationen von 0,5 bis 5 myg/ml ergaben cIL-2-Konzentrationen, die den Verlauf einer Dosis-Wirkungskurve mit einem Optimum bei 1 myg/ml aufweisen. Mit der niedrigsten (0,1 myg/ml) und höchsten (10 myg/ml) untersuchten Doxyzyklin- Konzentration konnte hingegen jeweils eine nur schwache Induktion der cIL-2- Produktion erzielt werden.
8. Diese cIL-2 produzierenden BHK-Klone sollen im Rahmen der klinischen Anwendung für die in vitro-Stimulation von LAK-Zellen durch Koinkubation mit angereicherten NK-Zellen von Tumorpatienten in einem kommerziell erhältlichen Bioreaktorsystem eingesetzt werden, welches ursprünglich für die einfache Herstellung monoklonaler Antikörper konstruiert worden war. In einem solchen System können beide Zellarten durch eine semipermeable Membran voneinander getrennt inkubiert werden. cIL-2 kann die Membran durchdringen und so eine kontinuierliche Stimulation zu LAK hervorrufen, während ein direkter Zell-Zell- Kontakt verhindert wird. Die IL-2-Gabe in Intervallen und die damit verbundene stark schwankende IL-2-Konzentration im Kulturmedium wie bei den bisherigen Kultursystemen wird dadurch vermieden. Die auf diese Weise erzeugten LAK sollen in einer adoptiven Tumorimmuntherapie beim Hund eingesetzt werden.">
 

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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-66865
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2008/6686/


Herstellung von kaninem Interleukin-2 (cIL-2) nach stabiler Transfektion der mesenchymalen BHK-Zelllinie mit Hilfe des Tet-on-Expressionssystems zur Erzeugung von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) für eine adoptive Tumorimmuntherapie beim Hund

Preis, Sandra Sara


Originalveröffentlichung: (2008) Giessen : VVB Laufersweiler 2008
pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.750 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Pathologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5346-8
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 12.11.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 17.12.2008
Kurzfassung auf Deutsch: 1. Der Literaturteil gibt zunächst eine kurze Übersicht über die Möglichkeiten der Immuntherapie und der adoptiven Immuntherapie von Tumoren beim Menschen und
beim Hund, wobei insbesondere auf eine Anwendung von Interleukin-2 (IL-2) und
den Einsatz von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) eingegangen wird.
Ziel dieser Arbeit war es nämlich, die mesenchymale Zelllinie BHK mit
molekularbiologischen Methoden (Tet-on-System) so zu verändern, dass sie in der
Lage ist, biologisch aktives IL-2 vom Hund (cIL-2) kontinuierlich zu produzieren. Dieses soll dann für eine adoptive Tumorimmuntherapie beim Hund für die klinische Anwendung zur Verfügung gestellt werden.

2. Dazu wurde zunächst eine cDNA für cIL-2 aus mit Percoll® isolierten, Con Astimulierten Hundeblutlymphozyten in einer RT-PCR gemäß der Publikation von
Dunham et al. (1995) amplifiziert. Die Sequenzierung der gewonnenen cDNA ergab
eine hundertprozentige Übereinstimmung mit der publizierten Sequenz (Dunham et
al., 1995).

3. Die Expression des cIL-2-Proteins sollte in BHK-Zellen durch das Tet-on-
Expressionssystem gesteuert werden. Dazu musste die cIL-2-cDNA zusammen mit
dem Reportergen Luciferase in das Response-Plasmid pTRUE eingebaut werden. Dies
gelang, indem zunächst Schnittstellen für Restriktionsenzyme flankierend zum
kodierenden Bereich in die cIL-2-cDNA eingebaut und durch
Restriktionsenzymverdau Überhänge mit sogenannten "Sticky Ends" produziert
wurden. Die erneute Sequenzierung der cIL-2-Sequenz ergab wiederum eine totale
Übereinstimmung zur von Dunham et al. (1995) publizierten Sequenz. Nachdem das
Response-Plasmid pTRUE und das Luciferase-Gen ebenfalls mit Restriktionsenzymen
geschnitten und so mit "Sticky Ends" versehen worden waren, erfolgte der
Zusammenbau dieser Elemente in einer Dreifachligation zu dem Response-Plasmid
pTRUE-IL-2.


4. Anschließend wurde eine transiente Transfektion des Response-Plasmids pTRUE-IL-2
in BHK-Tet-on-Zellen durchgeführt und die Aktivität des Reportergens überprüft.
Hierbei konnte nach der Induktion des Tet-on-Systems mit Doxyzyklin eine um etwa
das Tausendfache gesteigerte Aktivität der Luciferase gemessen werden.

5. Nach der stabilen Transfektion von pTRUE-IL-2 in BHK-Tet-on-Zellen wurden 12
Klone auf die Expression von Luciferase untersucht. 11 davon zeigten eine
Induzierbarkeit mit Stimulationsindizes von 2,6 bis 46,8. Bei einer Klon-Linie (A11)wurde ein inverses Verhalten festgestellt. Sie wies induziert eine geringere Luciferase-Expression auf als im nicht induzierten Versuchsansatz. Der zugrunde liegende Mechanismus bleibt allerdings unklar. Weitere Luciferase-Assays auch von reklonierten BHK-Linien bestätigten die Induzierbarkeit des Tet-on-Systems nach der stabilen Transfektion. Die Existenz der mRNA für cIL-2 in den transfizierten BHKKlonen wurde anschließend in einer RT-PCR nachgewiesen.

6. Weiterhin wurde überprüft, ob nicht-transfizierte, native BHK-Zellen eventuell Faktoren abgeben, die die Aktivität von Effektorzellen mit spontaner zytotoxischer Aktivität stimulieren oder blockieren. Dazu wurden Lymphozyten unter Anreicherung von NK-Zellen aus Hundeblut über einen 57,5 %igen Percoll®-Gradienten isoliert, in den Überständen von nativen BHK-Zellen inkubiert und ihre zytotoxische Aktivität in einem kolorimetrischen Farbstofftest, dem Rose Bengal Assay (RBA), gemessen. Durch die Behandlung mit diesen Überständen war keine Veränderung der zytotoxischen Aktivität nachweisbar.

7. Für den Nachweis der biologischen Aktivität des von den transfizierten BHK-Zellen sezernierten cIL-2 wurden Bioassays mit der IL-2-sensitiven Zelllinie CTLL-2 durchgeführt. Bei allen untersuchten BHK-Klonen war eine Produktion von biologisch aktivem cIL-2 nachweisbar. Die Menge des im induzierten Zustand sezernierten cIL-2 ließ sich jedoch schwer bestimmen, da die cIL-2-Produktion je nach Kulturbedingungen (Inkubationsdauer, Zellkonzentration der eingesetzten Klone) stark schwankte. Bei allen Klonen war eine basale cIL-2-Sekretion im nicht induzierten Zustand nachweisbar.


Unter serumfreien Bedingungen ließ sich die Produktion von cIL-2 durch die Zugabe von Doxyzyklin nicht induzieren. Unterschiedliche induzierende Doxyzyklin-Konzentrationen von 0,5 bis 5 myg/ml ergaben cIL-2-Konzentrationen, die den Verlauf
einer Dosis-Wirkungskurve mit einem Optimum bei 1 myg/ml aufweisen. Mit der
niedrigsten (0,1 myg/ml) und höchsten (10 myg/ml) untersuchten Doxyzyklin-
Konzentration konnte hingegen jeweils eine nur schwache Induktion der cIL-2-
Produktion erzielt werden.

8. Diese cIL-2 produzierenden BHK-Klone sollen im Rahmen der klinischen
Anwendung für die in vitro-Stimulation von LAK-Zellen durch Koinkubation mit
angereicherten NK-Zellen von Tumorpatienten in einem kommerziell erhältlichen
Bioreaktorsystem eingesetzt werden, welches ursprünglich für die einfache
Herstellung monoklonaler Antikörper konstruiert worden war. In einem solchen
System können beide Zellarten durch eine semipermeable Membran voneinander
getrennt inkubiert werden. cIL-2 kann die Membran durchdringen und so eine
kontinuierliche Stimulation zu LAK hervorrufen, während ein direkter Zell-Zell-
Kontakt verhindert wird. Die IL-2-Gabe in Intervallen und die damit verbundene stark schwankende IL-2-Konzentration im Kulturmedium wie bei den bisherigen
Kultursystemen wird dadurch vermieden. Die auf diese Weise erzeugten LAK sollen
in einer adoptiven Tumorimmuntherapie beim Hund eingesetzt werden.
Kurzfassung auf Englisch: 1. The literature section gives a short overview on the possibilities of immunotherapy and adoptive immunotherapy of human and canine tumor-bearing patients with special emphasis on the application of interleukin-2 (IL-2) and lymphokine-activated killer cells (LAK).

It was the aim of this study to modify mesenchymal BHK cells by molecular
biological means (tet-on expression system) so that these cells produce continuously biological active canine IL-2 (cIL-2). This cIL-2 will be provided for clinical application in an adoptive immunotherapy in tumor-bearing dogs.

2. For this purpose a cDNA for cIL-2 was amplified on basis of isolated and Con Astimulated lymphocytes of a dog according to the publication of Dunham et al. (1995)who had published primers and conditions of an RT-PCR for cIL-2. The cDNA generated under these conditions revealed total conformity with the sequence described by Dunham et al. (1995).

3. The expression of the cIL-2-protein by BHK cells should be controlled by the Tet-onexpression system. So the cIL-2 cDNA and the reporter gene luciferase had to be integrated to the response plasmid pTRUE. This was achieved by creating cutting sites for restriction enzymes in the non-coding regions adjacent to the cIL-2 gene. Digestion with these restriction enzymes created sticky ends. Another verification of the cDNA sequence was performed which showed again complete conformity with the sequence published by Dunham et al. (1995). The response plasmid pTRUE and the reporter gene were also digested by restriction enzymes which created sticky ends. Then the three elements were ligated to form the response plasmid pTRUE-IL-2.

4. The response plasmid pTRUE-IL-2 was transiently transfected to BHK Tet-on cells which already contain the regulator plasmid pEF-Tet-on permanently integrated to their genome. The expression of the luciferase was tested in a luciferase assay. The induction of the tet-on system by doxycyclin showed an approximately thousand fold increase of the luciferase activity.


5. After the stable transfection of pTRUE-IL-2 to BHK Tet-on cells 12 clones were tested on their expression of luciferase. Out of these 11 clones revealed inducability with stimulation indexes ranging from 2,6 to 46,8. One clone (A11) showed a reverse behaviour. In this clone luciferase expression after induction was lower than without induction. The underlying mechanism remains unclear. Additional luciferase assays of recloned BHK lines proofed the inducability of the Tet-on system after stable transfection. Prior to the testing of the biological activity of the secreted cIL-2 the mRNA of cIL-2 was detected in transfected BHK cells by RT-PCR.

6. Further a possible release of factors from native BHK cells influencing the activity of effector cells by stimulating or blocking their cytotoxic activity was also examined. For this lymphocytes enriched in NK cells were isolated from canine blood with a 57,5 % Percoll® gradient and exposed to the supernatants of native BHK cells. Afterwards their cytotoxic activity was measured by a colorimetric test, the Rose Bengal Assay (RBA). By treating with these supernatants no change in the cytotoxic activity could be demonstrated.

7. To proof the biological activity of the secreted cIL-2 by transfected BHK cells bioassays with the IL-2-sensitive cell line CTLL-2 were performed. All tested BHK clones revealed production of biological active cIL-2. The total amount of secreted cIL-2 after induction was difficult to determine because of the variations in the cIL-2 production depending on culture conditions (incubation period, cell concentration). All clones under study showed a basal secretion of cIL-2 in not induced conditions.

Without supplemented serum in the cell culture medium the cIL-2 could not be
induced by doxycycline. Several doxycycline concentrations from 0,5 myg/ml to
5 myg/ml revealed cIL-2 concentrations exhibiting a dose-effect relationship with an optimum of 1 myg/ml. With the lowest (0,1 myg/ml) and the highest (10 myg/ml) tested doxycycline concentrations only a weak induction of cIL-2 production was achieved.


8. These created cIL-2 producing BHK clones are to be used in clinical applications for the stimulation of LAK cells in vitro by coincubation with enriched NK cells of tumorbearing dogs in a commercially available bioreactor system which was originally designed for simple production of monoclonal antibodies. In this system both cell types can be coincubated separated by a semipermeable membrane. cIL-2 can pass the membrane and can generate a continuous stimulation of LAK without direct cell-tocell-
contact. This avoids an intermitting supplementation of IL-2 to the cell culture
medium and thus variable IL-2 concentrations in the medium like in hitherto culture systems. LAK produced by this method are to be used in an adoptive tumor
immunotherapy in dogs.