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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-64777
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2008/6477/


Untersuchungen zum Nachweis von verotoxinogenen E. coli (VTEC), speziell Serovar O157, in Lebensmitteln tierischen Ursprungs mit verschiedenen Anreicherungsverfahren

Delorme, Sandrine


Originalveröffentlichung: (2008) Giessen : VVB Laufersweiler 2008
pdf-Format: Dokument 1.pdf (588 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.08.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 17.10.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Seit 1982 sind die Verotoxin-bildenden E. coli (VTEC) und dabei insbesondere die Untergruppe der enterohämorrhagischen Stämme (EHEC) als Verursacher lebensmittelbedingter Infektionen des Menschen, mit teilweise schwerwiegenden Komplikationen, bekannt. Große und kleine Wiederkäuer gelten weltweit als Reservoir dieser Erreger, so dass rohe oder nicht ausreichend erhitzte Lebensmittel, vor allem der Tierart Rind, eine Hauptinfektionsquelle darstellen.


Bekanntermaßen sind in kontaminierten Lebensmitteln nur wenige Zellen vorhanden. Für den Nachweis innerhalb einer heterogenen und um mehrere Zehnerpotenzen höheren Mikroflora der rohen Lebensmittel tierischen Ursprungs ist daher vor dem Subkultivierungsschritt ein Anreicherungsschritt notwendig.


Von Januar 1996 bis April 1997 war das Ziel der eigenen Untersuchungen, Daten zur Prävalenz von VTEC-Stämmen unter besonderer Berücksichtigung der E. coli Serogruppe O157 in Lebensmitteln tierischen Ursprungs, insbesondere aus dem Einzel- und Großhandel im Gießener Raum (Deutschland), zu ermitteln. Des Weiteren sollte Lammfleisch aus Australien, das über die Grenzkontrollstelle am Frankfurter Flughafen importiert worden war, auf das Vorkommen von VTEC untersucht werden. Dabei wurden parallel zwei verschiedene Anreicherungsmedien (Brillantgrün-Galle-Lactose [BRILA] und Laurylsulfat-Tryptose plus Novobiocin [LST+N]) mit zwei sich anschließenden Nachweisverfahren: der Enzyme immunoassay-Test (EIA) für Verotoxine und die immunomagnetische Separation (IMS) für die Serogruppe O157 eingesetzt.



Im EIA positiv oder verdächtig reagierende Anreicherungen (Extinktionswert > 0,100) wurden 70 µl der Übernachtkultur jeweils auf 5 Hemorrhagic Colitis-Agar-Platten (HC) ausgespatelt. Nach 16-18 h Bebrütung bei 41 °C wurde eine HC-Platte ausgesucht, auf der verdächtigen Kolonien gewachsen waren. Bis zu fünf phänotypisch differente Kolonien wurden in einem Eppendorf-Gefäß gepoolt. Eine Hälfte des Pools wurde auf Plate count-Agar-Platten (PC) subkultiviert, die andere Hälfte wurde mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Einsatz der degenerierten Primer MK1/MK2 untersucht. Im Falle eines positiven PCR-Resultates erfolgte anschließend eine Nachuntersuchung der Einzelkolonien des betreffenden Pools.


Nach der IMS-Probenbearbeitung wurden jeweils 50 µl des Sediments auf dem Cefixim-Tellurit-Sorbit-MacConkey-Agar (CT-SMAC) subkultiviert. Die verdächtig erscheinenden Kolonien wurden mit O157-Antiserum agglutiniert. Nach Ausschluss einer Autoagglutination wurden diese Kolonien weiterhin mit einem H7-Antiserum geprüft. Die einzelnen Kolonien wurden auf HC- und PC-Agar subkultiviert. Präsumtive E. coli O157 wurden mit Hilfe der PCR auf verschiedene Virulenzfaktoren untersucht.


Die besten Ergebnisse wurden mit einer Anreicherung in BRILA, gefolgt von einer Untersuchung mit einem Verotoxin-EIA, erzielt. Proben mit positiven oder verdächtigen Ergebnissen wurden eingefroren und erneut untersucht. Dabei wurden weitere VTEC gefunden. Kälte bewirkte keine vollständige Inaktivierung von VTEC-Stämmen.


392 Lebensmittel wurden untersucht, von denen 14 (3,6 %) mit VTEC kontaminiert waren. Davon waren 12 Lammprodukte, ein Rindfleischprodukt und ein Schweinefleischprodukt. Im Gegensatz zu den Fleischprodukten ergaben die Käseproben negative Ergebnisse. Es wurden 14 VTEC-Serogruppen O6:H-, O6:H10, O7:H-, O8:H-, O8,60:H51, O8,60:H-, O22:H5, O65:H-, O75:H5, O84:H21, O96:H-, O112a,c:H, O157:H- und ONT:H- nachgewiesen. Die Virulenzmuster waren dabei sehr heterogen. Bei einer Probe aus Schweinefleisch wurde ein O157:H7-Stamm isoliert. Mit Ausnahme der O157:H- waren die biochemischen Eigenschaften der isolierten VTEC, die von saprophytären E. coli.


Im Allgemeinen gelten als Risikonahrungsmittel diejenigen, die roh verzehrt werden, wie Rohmilch, Rohmilchkäse und rohe Rinderhackfleischerzeugnisse. Von zunehmender und unterschätzter Bedeutung sind Lebensmittel pflanzlichen Ursprungs, die mit O157-haltigen Rinderfäzes verschmutzt wurden. Eine weitere Kontaminationsquelle ist symptomlos ausscheidendes ersonal, welches im Lebensmittelgewinnungssektor arbeitet und dabei Lebensmittel kontaminieren kann.
Kurzfassung auf Englisch: Since 1982, Verotoxin-producing E. coli (VTEC), and particularly their enterohemorrhagic strains subgroup (EHEC), have been known as causative agents of foodborne infections with partially severe complications in humans. Globally, large and small ruminants are the main reservoir of these pathogens. Thus raw or insufficiently heated food, particularly that of beef origin, represents a major source of infection.


It is common knowledge that only few cells of VTEC are present in contaminated food. Due to the heterogenous microflora of raw foods of animal origin, it is necessary to perform an enrichment step before subcultivation.


From January 1996 until April 1997, the aim of this study was to establish data on the prevalence of VTEC-strains, especially serovar O157, in food of animal origin coming from small grocery stores and supermarkets in the region of Giessen, Germany. Additionally, lamb meat freshly imported from Australia came directly to Giessen via the border check point at Frankfurt Airport and was examined for the presence of VTEC. After the use of two enrichment media (Brillant Green Bile Lactose [BRILA] and Lauryl Sulphate Tryptose with Novobiocin [LST+N]), the samples were screened with two different detection methods: Enzyme immnoassay-Test (EIA) for verotoxins and Immunomagnetic separation (IMS) for O157:H7.


If samples were EIA-positive or suspicious (extinction value >0,100), 70 µl of the overnight broth were spread onto five Hemorrhagic Colitis (HC)-Agar-plates. After 16-18 h incubation at 41 °C a plate with suspicious colonies was chosen and 5 colonies were pooled in an Eppendorf container. Half of the pool was spread on Plate Count (PC)-Plates and the other half was screened in the Polymerase Chain Reaction (PCR) with the primers MK1/MK2. In case of a PCR positive result, colonies of the PC-Plate would be rechecked for their belonging to the E. coli group and their VT-toxins.


After IMS, 50 µl of the sediment was spread onto Cefixim-Tellurit-Sorbit-MacConkey (CT-SMAC)-Agar. Presumptive colonies were agglutinated with O157-Antiserum. If no autoagglutination occurred, these colonies were checked with H7-Antiserum. Each colony was then subcultivated onto HC- and PC-Agars. The virulence factors of the presumptive E.coli O157:H7 were determined by a PCR technique.


In this study, most of the VTECs were isolated after incubation in BRILA enrichment and an EIA-test detection. The samples with positive or suspicious results were frozen and re-tested. VTECs were found again during the second detection, which indicates that the cold did not affect them.


Of 392 food samples (meat and cheese products), 14 (3,6 %) meat products were contaminated with VTEC (12 lamb products, 1 beef and 1 pork). None of the cheese products were VTEC-positive. The isolated VTEC showed as many as 14 different serotypes: O6:H-, O6:H10, O7:H-, O8:H-, O8,60:H51, O8,60:H-, O22:H5, O65:H-, O75:H5, O84:H21, O96:H-, O112a,c:H, O157:H- und ONT:H-. The virulence pattern was also very variable. One sample of pork carried a O157:H-. With the exception of the O157:H-, their biochemical characteristics were similar to saprophytes E. coli.


In general the risky food products remain raw milk, raw milk cheese and raw ground beef. Attention should also be paid to the vegetable products contaminated with cattle feces. Lastly another source of contamination is the symptom-free carrier working in the food industry.