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Gewinnung und elektrophysiologische Charakterisierung von Listeriolysin O-haltigen Überständen aus Bakterienkulturen von Listeria monocytogenes und ihrer Mutanten

Kaschinski, Stanislav


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Rudolf-Buchheim-Institut für Pharmakologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.09.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 13.10.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Das Peptid Listeriolysin O (Mr=58 kD) ist der wichtigste Virulenzfaktor von L. monocytogenes.
Es ist eines von 23 Mitgliedern aus der Familie der cholesterolabhängigen
und thiolaktivierbaren Zytolysine (CDTXs, cholesterol-dependent toxins).
Neben der Modulation verschiedener zellulärer Signalkaskaden weist das Toxin
Listeriolysin O eine an lebenden, eukaryontischen Zellen elektrophysiologisch messbare
poreninduzierende Wirkung auf. Die Porenbildung in der eukaryontischen Zellmembran
spielt eine Schlüsselrolle in der Pathogenität von L. monocytogenes.

Zunächst wurde eine Methode etabliert, mit der sich die für die elektrophysiologischen
Messungen notwendigen Toxinmengen schnell, einfach und reproduzierbar
gewinnen ließen. Mit Hilfe des herausgearbeiteten Isolationsprotokolls wurde
die poreninduzierende Kinetik von zwei Listeriolysin O-DNA-Mutanten aus L. monocytogenes
hlyW492A- und L. monocytogenes hlyC484S-Bakterienkulturen, von
denen bis zu diesem Zeitpunkt keine gereinigten Toxinformen existierten, gewonnen
und elektrophysiologisch charakterisiert. Erstmalig konnte eindrucksvoll eine
Steigerung der poreninduzierenden Bildung von LLO mit Steigerung der Temperatur
(Q10-Wert von 3-4) demonstriert werden. Die nicht poreninduzierende LLO-DNA
Mutante hlyW492A zeigte auch bei einer Messtemperatur von 37°C keine
Poreninduktion. Für die LLO-DNA-Mutante hlyC484S konnte gezeigt werden, dass
diese Toxinform eine bis um den Faktor 10 höhere poreninduzierende Potenz
aufweist als LLO-WT. Diese Untersuchungen veranschaulichten die große Rolle des
einzigen Cysteinrests in der Primärstruktur des LLO-Moleküls, die in der Literatur als
Thiolaktivierung bekannt ist.

Für das thiolhaltige Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) konnte gezeigt werden,
dass es die poreninduzierende Potenz von LLO um den Faktor 3,5 steigert. Ebenfalls
konnte eine Steigerung der porenbildenden Potenz von LLO durch den thiolhaltigen
ACE-Hemmer Captopril demonstriert werden. Überraschenderweise wurde Protamin,
eine weitere thiolhaltige Substanz, als Blocker der LLO-induzierten Poren identifiziert.
Für Protamin konnte erstmalig elektrophysiologisch gezeigt werden, dass diese
Substanz eine eigene poreninduzierende Wirkung aufweist und dass dieser Effekt
stark vom Membranhaltepotential der Zelle abhängt.
Kurzfassung auf Englisch: The peptide toxin listeriolysin O (LLO; Mw = 58 kDa) is an essential virulence factor
of the gram-positive, facultative intracellular bacterium L. monocytogenes. It is one of
23 members of the family of cholesterol-dependent and thiol-activated cytolysins (=
CDTXs, cholesterol-dependent toxins). Further to its ability to modulate various
cellular signalling events, LLO forms pores in the plasma membrane of viable
eukaryotic cells, which can be detected electrophysiologically. The pore forming
ability of LLO plays a key role in the pathogenicity of L. monocytogenes.

The present work established a method that allows rapid, easy and reproducible
preparation of LLO amounts sufficient for a number of electrophysiological
measurements. Due to this preparation method it became possible to characterize
the kinetics of pore formation and further properties of two LLO mutants from L.
monocytogenes hlyW492A and hlyC484S, which were not available as purified
toxins. For the first time it was demonstrated that the pore formation by LLO strongly
depends on temperature and is significantly increased at physiological body
temperature compared to room temperature. In contrast, no increase in pore-forming
activity by elevation of the temperature to 37 °C was observed for the LLO mutant
hlyW492A, which already has a strongly reduced pore forming potency at room
temperature, compared to wild-type LLO. On the other hand, an about tenfold
increase in pore forming activity compared to wild-type LLO was found for the LLO
mutant hlyC484S, relating to the latency between toxin application and the
registration of the first pore. This showed that the single cysteine residue in the LLO
molecule attenuates pore formation, possibly by provoking LLO molecules to
accumulate as dimers with reduced pore forming potency.

The phenomenon of thiol activation of LLO was also investigated in the present work.
The thiol-containing reducing agent dithiothreitol led to a marked increase in pore
formation by LLO. This was also observed for the thiol-containing angiotensinconverting-
enzyme inhibitor captopril. In contrast, protamine, a thiol-containing
peptide, turned out to be a blocker of LLO-induced pores. In addition, it was
demonstrated for the first time that protamine itself in higher concentrations can
induce pores. This effect strongly depends on the membrane holding potential.