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URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2008/6094/


Etablierung eines revers–genetischen Systems für feline Coronaviren

Tekes, Gergely


Originalveröffentlichung: (2008) Giessen : VVB Laufersweiler 2008
pdf-Format: Dokument 1.pdf (1.790 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Virologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5325-3
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.07.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 31.07.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Etablierung eines revers-genetischen Systems für ein Serotyp I felines Coronavirus (FCoV). Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:

1) Als Grundlage für die Etablierung des Systems wurde die komplette Genomsequenz
des FCoV Stammes Black bestimmt und anhand dieser Sequenz der Genomaufbau
ermittelt. Es ließ sich der für Coronaviren typische Genomaufbau nachweisen.


2) Die Herstellung eines infektiösen Klons beinhaltete die Integration einer kompletten
cDNA Kopie des FCoV Stammes Black in das Vaccinia Virus Genom, welches als
Vektor diente. Die coronavirale cDNA wurde in vitro transkribiert und die synthetische
RNA in Zellen elektroporiert. Rekombinante FCoV ließen sich nachweisen und somit
war die synthetische RNA infektiös, also in der Lage, den coronaviralen
Replikationszyklus zu initiieren und zu durchlaufen. Die Analyse der gewonnenen
rekombinanten Viren erfolgte nach Infektion feliner Zellkulturen mit verschiedenen
Ansätzen. Dabei konnte festgestellt werden, dass die rekombinanten Viren die
gleichen Eigenschaften wie der ursprüngliche FCoV Stamm Black besitzen.


3) In nachfolgenden Versuchen erfolgte die Herstellung zweier Reportergenexprimierender
FCoV mit dem etablierten revers-genetischen System. Dabei wurden
im FCoV Stamm Black Genom die akzessorischen Gene 3abc durch das „green
fluorescent protein“ (GFP) oder Renilla Luciferase ersetzt. Die stabile Expression der
Reportergene konnte in felinen Zellkulturen nachgewiesen werden.


4) Feline Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen (DCs), die als Zielzellen
sowohl von FCoV als auch von anderen Coronaviren gelten, wurden mit Wildtyp und
den Reportergen-exprimierenden FCoV in vitro infiziert. Die Infektion von
monozytären Zellen konnte ausschließlich mit Hilfe der GFP exprimierenden
Mutanten nachgewiesen werden.
Kurzfassung auf Englisch: In this study a reverse genetic system for a serotype I feline coronavirus was established.
The following results were obtained:

1) As basis for the establishment of a reverse genetic system the complete genomic
sequence of FCoV strain Black was determined. The sequence analysis revealed the
typical genome organization for coronavirus.


2) For the generation of an infectious clone the full-length FCoV strain Black cDNA was
introduced into vaccinia virus as cloning vector. The FCoV cDNA was used for in vitro
transcription and the synthesized RNA electroporated into cells. Recombinant FCoV
could be detected which showed that the in vitro transcribed RNA was infectious and
could initiate the coronavirus replication cycle. The resulting recombinant virus was
analyzed in feline cell culture using different approaches. It could be demonstrated
that the properties of the recombinant virus are indistinguishable from those of FCoV
wild type virus strain Black.


3) In subsequent experiments based on the newly established reverse genetic system,
two reporter gene expressing recombinant FCoV were generated. The accessory
genes 3abc were replaced by genes encoding the green fluorescent protein (GFP)
and Renilla luciferase. The stable expression of these reporter genes was
demonstrated in feline cell culture.


4) Feline monocytes, macrophages and dendritic cells (DCs) which are considered to be
important target cells for FCoV and other coronaviruses were infected with the
wildtype and the reporter gene expressing FCoV. The infection of the monocytic cells
was exclusively shown with the GFP expressing mutant.