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A functional study on the multilateral symbiosis of the fungal order Sebacinales with plant hosts and bacteria

Funktionale Studien der Symbiosen zwischen Pilzen der Ordnung Sebacinales mit Pflanzen und Bakterien

Sharma, Monica


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-60617
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2008/6061/

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Freie Schlagwörter (Englisch): Symbiosis , Sebacinales , Rhizobium , Endobacteria , Biodiversity
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institute of Phytopathology and Applied Zoology
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.06.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 16.07.2008
Kurzfassung auf Englisch: The order Sebacinales is the most basal order of Hymenomycetes (Basidiomycetes) which contains an amazing diversity of mycorrhiza. Frequent detection of Sebacinales in ecological studies using various molecular techniques suggests their possible role in shaping plant communities. The root-colonizing mutualistic fungus Piriformospora indica is axenically cultivable and represent the model organism for symbiotic species of the order Sebacinales. In the present work, axenic cultures of seven isolates of Sebacina vermifera have been established and their phylogenetic relationship was characterized by sequencing and comparing nuclear genes coding for the internal transcribed spacer (ITS) region. Despite their sequence similarity for the large ribosomal subunit (nucLSU), they showed difference in the ITS region. Isolates were clustered into three different groups based on their ITS sequences. Morphological variation in terms of colony morphology and growth, hyphal and spore size and number of nuclei per hyphal cell and spore was also observed for the isolates. The isolates were further evaluated in barley for their biological potential with respect to growth promotion and ability to induce systemic resistance against the biotrophic leaf pathogen Blumeria graminis f. sp. hordei (powdery mildew). All isolates conferred beneficial effects (growth augmentation and induced resistance) on two cultivars of barley i.e., cvs. Ingrid and Golden Promise. Hence, the data support the working hypothesis that the mutualistic symbiosis of crop plants and Sebacinales has a great potential for sustainable agriculture.
While culturing P. indica, initial signs of bacterial presence were observed several times after mechanical rupturing of fungal mycelium. Using universal primers, bacterial 16S-rRNA gene from the metagenomic DNA of P. indica and seven isolates of S. vermifera was amplified. Cloning, sequencing and phylogenetic analysis of 16S-rRNA gene sequences revealed the association of P. indica with Rhizobium radiobacter, while 3 isolates S. vermifera complex showed association with 3 different bacteria belonging to Paenibacillus sp., Acinetobacter sp. and Rhodococcus sp. R. radiobacter (PABac) was isolated from P. indica and its axenic culture was established. All bacterial sequences from P. indica and PABac were identical within the amplified region of the bacterial 16S-rRNA gene displaying the presence of a unique bacterial isolate. This notion was confirmed by detecting single dominant band in denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of 16S-rRNA gene. The Sebacinales associated bacteria were localized using fluorescence in situ hybridization (FISH). R. radiobacter could be detected close to and in the hyphal walls of P. indica. Paenibacillus sp. was localized within the cytosol of S. vermifera MAFF305838. Endocellular nature of Paenibacillus sp. was further confirmed by transmission electron microscopy (TEM).Vertical transmission of R. radiobacter was proved by single spore cultures of P. indica. Real time quantitative PCR showed an average of 0.035 ng of R. radiobacter DNA per 100 ng of P. indica DNA. Various attempts to cure P. indica from bacteria (by growing single spore cultures, young mycelium and regenerated hyphal protoplast on medium containing antibiotic for five generations) were not successful which indeed suggests towards strong association between P. indica - R. radiobacter. Initial biochemical characterization of R. radiobacter revealed its ability to produce auxin from tryptophan. Biological activities (growth augmentation and induction of systemic resistance against powdery mildew) of R. radiobacter in host plants (Hordeum vulgare and Arabidopsis thaliana) were demonstrated. In addition, using Arabidopsis mutants defective in various defence pathways clarified that R. radiobacter induces a type of resistance reminiscent of jasmonate-dependent induced systemic resistance (ISR) provided by non-pathogenic rhizobacteria. Thus, the Sebacinales-associated bacteria might be involved in the growth response of the host plant as well as in the evasion of the host defense response by the mutualistic fungi. Together, these findings suggest that Sebacinales species undergo complex symbioses involving bacteria and requires reconsideration of the role played by the fungus in its symbiotic interaction with the plant.
Kurzfassung auf Deutsch: In der hier vorliegenden Arbeit wurde die axenische Kultivierung von sieben Sebacina vermifera Isolaten etabliert und ihre phylogenetische Verwandtschaft durch Sequenzanalysen und den Vergleich nuklearer Gensequenzen aufgeklärt. Die Sequenzen der großen ribosomalen Untereinheiten der Isolate weisen eine große Ähnlichkeit auf, im Gegensatz zu der Region, die für die „internal transcribed spacer region“ (ITS) codiert. Diese Unterschiede ermöglichten es, die Isolate in drei verschiedene Gruppen zusammenzufassen. Des Weiteren wurde das Potential der einzelnen Isolate untersucht, ein verstärktes Wachstum und eine erhöhte Resistenz gegen den biotrophen Mehltaupilz Blumeria graminis f. sp. hordei in Gerste zu induzieren. In den Gerstekultivaren cvs. Ingrid und Golden Promise zeigten alle Isolate positive biologische Effekte. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass der mutualistische Symbiont in Getreidepflanzen ein großes Potential für nachhaltige Landwirtschaft birgt.
Bei der Kultivierung und anschließenden mechanischen Zerkleinerung von P. indica Mycel wurde mehrfach das Auftreten von Bakterien beobachtet. Unter Verwendung universeller Primer für die bakterielle 16S-rRNA konnten mittels PCR-Reaktionen Amplifikate aus metagenomischer P. indica DNA als auch den S. vermifera Isolaten gewonnen werden. Mittels anschließender Klonierung, Sequenzierung und phylogenetsicher Analyse wurde in drei der S. vermifera Isolate eine Assoziationen mit Bakterien der Gattung Paenibacillus sp., Acinetobacter sp. bzw. Rhodococcus sp. gefunden. Bezüglich P. indica zeigte die Analyse eine Assoziation mit dem Bakterium Rhizobium radiobacter (PABac). Alle aus P. indica isolierten bakteriellen Sequenzen waren mit der bakteriellen 16S-rRNA von PABac identisch, was auf das Vorliegen eines einzelnen Bakterienstammes in Assoziation mit dem Pilz hinweist. Diese Vermutung wurde dadurch bestätigt, dass auch in einer denaturierenden Gradientengelelektrophorese (DGGE) nur eine einzelne 16S-rRNA Bande gefunden werden konnte. Mit fluorescence in situ Hybridisierung (FISH) konnte R. radiobacter in der Nähe von und in den Zellwänden der Hyphen von P. indica detektiert werden. Paenibacillus sp. war im Cytosol von S. vermifera MAFF305838 nachweisbar. Das endozelluläre Vorkommen von Paenibacillus sp. wurde durch Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) weiter bestätigt. Vertikale Transmission von R. radiobacter wurde durch Einzelsporkultivierung von P. indica gezeigt. Verschiedene Versuche, durch die Anzucht von Einzelsporen, jungem Mycel oder regenerierten Hyphenprotoplasten bakterienfreien Pilz zu erhalten, schlugen fehl. Dies weist auf eine starke Assoziation zwischen P.indica und R. radiobacter hin. Zudem zeigte R. radiobacter biologische Aktivität in den Wirtspflanzen Hordeum vulgare und Arabidopsis thaliana. Ein Test von Arabidopsis-Mutanten mit Defekten in verschiedenen Abwehrsignalwegen zeigte, dass die von R. radiobacter induzierte Resistenz der jasmonatabhängigen induzierten systemischen Resistenz (ISR) nicht-pathogener Rhizobakterien ähnelt. Alles in allem deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass Sebacinales eine komplexe Symbiose unter Einbezug von Bakterien mit Pflanzen eingehen, was eine neue Beurteilung der Rolle des Pilzes in der Interaktion mit der Pflanze sinnvoll erscheinen lässt.
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