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Laser- Mikrodissektion und molekulare Analyse von endostalen "Lining Cells" aus mineralisiertem humanem Knochen

Dierkes, Christian


Originalveröffentlichung: (2008) Giessen : VVB Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (1.805 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-60006
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2008/6000/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Pathologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 3-8359-5320-6
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.06.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 02.07.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Die Osteoporose generell und vor allem der geschlechtsunabhängige Verlust der Knochenmasse im Alter stellen bedeutende Morbiditäts- und Mortalitätsfaktoren für die alternden Gesellschaften der westlichen Hemisphäre dar. Um neue Therapiestrategien zu entwickeln und bekannte Mechanismen aus Tiermodellen verschiedener Spezies auf die komplizierten Umbauvorgänge im menschlichen Knochen zu übertragen sind Untersuchungen der Zell- Zell- Interaktion, vor allem zwischen Osteoblasten- und Osteoklasten im Rahmen des Knochenumbaus notwendig. Dieser Umbau findet in einem spezialisierten Kompartiment, dem sog. "Bone remodelling compartment" statt und schließt eine weiter Zellgruppe, die "Lining Cells", die 75% der endostealen Oberflächen des trabekulären Knochens im menschlichen Skelett bedecken, mit ein. Obwohl in hoher Zahl vorhanden, sind die "Lining Cells" bisher nicht im Fokus der Untersuchungen zum Knochenstoffwechsel gewesen. Eine Schwierigkeit besteht in der genauen Abgrenzung von Osteoblasten und in der Isolation dieser Zellen von der Knochenoberfläche.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß mit Hilfe der Laser- unterstützten Mikrodissektion eine exakte Isolation der "Lining Cells" von den endostealen Oberflächen aus nativem humanen Knochen möglich ist. Dazu wurde ein einfaches Protokoll zur Gefrierschnittaufarbeitung von nativem, mineralisiertem humanem Knochen mit konsekutiver Kernfärbung etabliert, welches eine schnelle Bearbeitung der Proben erlaubt und somit eine Beeinträchtigung von molekularbiologischen Untersuchungen durch Proteinverlust minimiert.
Bei der Untersuchung der "Lining Cells" mittels qualitativer RT-PCR konnte als Referenzgen Cbfa1 und zum Studium kataboler Eigenschaften die Expression von mRNA für MMP13 und TIMP-1 nachgewiesen werden. Beide Enzyme spielen eine wichtige Rolle, nicht nur für die Matrixdegeneration (MMP13), sonder auch für andere Zellfunktionen, wie den Schutz vor Apoptose (TIMP-1). Besonders die Expression von MMP13 ist ein Indiz für eine mögliche katabole Funktion der "Lining Cells" im Knochenstoffwechsel und besonders im Knochen des alternden Menschen. Möglicherweise kommt es hier zu einem synergistischen Knochenabbau, zusammen mit der osteoklastären Resorption mineralisierter Matrix. Die Arbeit bietet durch Adaptation der Laser- unterstützen Mikrodissektion einen neuen methodischen Zugang zur Untersuchung verschiedener Knochenzelltypen auf molekularer Ebene in ihrem eigenen Mikromilieu.
Kurzfassung auf Englisch: Osteoporosis and in particular the slow and gender independent bone loss with increasing age is a major cause for morbidity and mortalitiy leading to an increased risk of fractures in the western civilisations. To further investigate cell- cell interaction, especially between osteoclasts and osteoblasts in the human bones in order to evaluate new targets for anti- resorptive therapies, a method has to be established, which opens the acces to different cells of human bone directly in their complex microenvironment. This is necessary to check wether results of different animal models at the molecular level apply to human bone tissue as well. Bone remodelling takes place in a specialized compartment called the "bone remodelling compartment" which encloses as one of the types of cells, the bone lining cells. So far, the properties of endosteal bone lining cells have not been studied carefully although they cover almost 75% of endosteal bone surfaces in human cancellous bone. This might be due to a lack of knowledge concerning their exact phenotype and because of difficulties in isolating bone lining cells from their complex microenvironment.
The present study demonstrates that laser-assisted microdissection is a highly suitable tool for the isolation of bone lining cells from native, mineralized human bone. For this purpose, a quick and simple protocoll of cryosectioning in combination with a staining method utilising Nuclear Fast Red was established in order to minimize protein loss of the dissected cells.
Examining the dissected bone lining cells by qualitative RT-PCR demonstrated Cbfa1 as reference gene of the osteoblastic lineage and for catabolic properties the expression profile of mRNA for MMP13 and TIMP-1. Both enzymes play a pivotal role for matrix degradation (MMP13) and for unknown reasons by their anti-apoptotic effect (TIMP-1). Thus the expression of MMP13 indicates a possible catabolic function of bone lining cells, especially for the slow bone loss in aging man. Bone lining cells may act synergistically with osteoclastic bone resorption through this process. The adaptation of laser-assisted microdissection to bone tissue presents a new promising approach to study different bone cells in their specific complex microenvironment.
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