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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-59466
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2008/5946/


Untersuchung zur funktionellen Bedeutung von VDAC in weiblichen Gameten des Rindes und des Marmoset-Affen

Uhl, Dorothee


Originalveröffentlichung: (2008) Giessen : VVB Laufersweiler 2008
pdf-Format: Dokument 1.pdf (1.868 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und -Embryologie u. Zentrum für Dermatologie und Andrologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5285-0
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.04.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 17.06.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Voltage-dependent anion channels (VDACs) besitzen eine Molekularmasse von 30-36 kDa und kommen in der äußeren mitochondrialen Membran, in der Plasmamembran von Eukaryoten und in der Bakterienzellmembran vor. Bisher sind drei VDAC-Subtypen bekannt, VDAC1, VDAC2 und VDAC3. Mittels elektrophysiologischer Untersuchungen mit rekombinantem VDAC1-und 2-Protein wurden den Ionenflux regulierende, porenbildende Eigenschaften nachgewiesen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden das Vorkommen und die mögliche physiologische Bedeutung der drei VDAC-Subtypen VDAC1, VDAC2 und VDAC3, im bovinen und im Marmoset-Ovar untersucht. Mit Hilfe der RT-PCR konnte die Expression VDAC-kodierender Gene in bovinen Oozyten für VDAC1, 2, und 3 und erstmals in Callithrix jacchus-Oozyten für VDAC1 und 3 gezeigt werden. Die Ergebnisse wurden jeweils durch Sequenzierung der Amplifikate bestätigt. Ebenfalls konnte VDAC-Protein mit Hilfe von subtypspezifischen anti-VDAC-Antikörpern (anti-VDAC1, -2 und -3) immunhistochemisch im bovinen und zum ersten Mal im Marmoset-Ovar nachgewiesen werden. In den untersuchten Ovarien zeigten sich sowohl speziesspezifische als auch vom Follikelstadium abhängige Unterschiede in der Lokalisation und in der Intensität der Immunreaktion der nachgewiesenen VDAC-Proteine. VDAC1- und VDAC3-Protein wurde in bovinen Oozyten und Follikelzellen aller Follikelstadien (Primordial- bis Tertiärfollikel) gefunden. VDAC2 konnte im bovinen Ovar hingegen nicht detektiert werden. Im Marmoset-Ovar wurde VDAC1 in Oozyten und Follikelzellen aller Follikelstadien (Primordial- bis Tertiärfollikel) nachgewiesen, während VDAC2 ausschließlich in Oozyten von Primär-, Sekundär- und Tertiärfollikeln vorkam. VDAC3-Protein konnte mit dem subtypspezifischen anti-VDAC3-Antikörper AS P31 nicht visualisiert werden. Ergänzend zu den immunhistochemischen Experimenten bestätigten immunzytochemische Untersuchungen mittels indirekter Immunfloureszenz und konfokaler Lasermikroskopie das Vorhandensein von VDAC1- und VDAC3-Protein in bovinen Oozyten. VDAC1 konnte mit dieser Methode sowohl in der Plasmamembran als auch intrazytoplasmatisch, VDAC3 ausschließlich intrazytoplasmatisch lokalisiert werden.

Zur Überprüfung der funktionellen Relevanz der durch die Antikörper detektierten VDAC- Epitope wurden Untersuchungen zur Volumenregulation, speziell zum „Regulatory Volume Decrease“ (RVD), nach hypotoner Stimulation an bovinen Oozyten durchgeführt. Die Oozyten wurden vor der digitalphotographischen Volumenmessung entweder in einem subtypspezifischen anti-VDAC-Antikörperserum präinkubiert, oder die Antiseren wurden direkt in die Oozyten injiziert. Ein statistisch signifikanter inhibierender Effekt auf das RVD konnte sowohl nach der Injektion des anti-VDAC2-Antiserums AS P45 als auch nach der Injektion bzw. Inkubation des anti-VDAC3-Antiserum AS P31 beobachtet werden. Weder die Inkubation noch die Injektion von anti-VDAC1-Antiserum AS P6 oder die Inkubation mit AS P45 führten zu einer negativen Beeinflussung des RVD. Die erzielten Ergebnisse der Arbeit und Daten aus der Literatur weisen darauf hin, dass eine Interaktion von VDAC mit Komponenten des Zytoskeletts verantwortlich für das RVD sein könnte. Weitere Studien sind notwendig, um diese Hypothese zu unterstützen.

Die im Rahmen der Dissertation erzielten Ergebnisse zur Synthese, Lokalisation und Funktion von VDAC-Isoformen im Ovar von Rind und Marmoset (Callithrix jacchus) können Ausgangspunkt für weitere wissenschaftliche (z.B. funktionelle Bedeutung von VDAC-Proteinen in der Physiologie der Fortpflanzung von Säugetieren) und klinische Fragestellungen (z. B. bei der künstlichen Befruchtung) sein. Die Ergebnisse können sowohl für die Human- als auch für die Veterinärmedizin wichtige Hinweise zum Verständnis der Biologie der Fortpflanzung geben.
Kurzfassung auf Englisch: Voltage-dependent anion channels (VDAC) are abundant not only in mitochondria but also in mammalian plasma membranes. Little is known about the presence and the function of VDAC- isoforms in mammalian ovaries. In this study the expression of VDAC genes in bovine and Callithrix jacchus oocytes was evaluated by the identification of oocyte mRNA using the RT-PCR technique. Transcripts of VDAC1, 2, and 3 were detected in oocytes of both species. Sequencing of amplification products obtained from bovine oocytes confirmed that they represent VDAC1, 2 and 3. Using marmoset oocytes sequencing revealed the abundance of VDAC1 and VDAC3.

In order to determine whether VDAC proteins are present in bovine and marmoset ovary cells, immunohistochemical studies were performed using isoform-specific anti-VDAC-antibodies. In result, clear staining could be obtained for VDAC1 and VDAC3 in bovine oocytes as well as in follicle cells of all follicular stages (primordial – tertiary follicles). While RT-PCR transcription of VDAC2 was shown, no VDAC2 protein could be detected by immunohistochemical methods.

In the marmoset, anti-VDAC1-antibodies demonstrated the presence of cytoplasmatic VDAC1 protein in oocytes and in follicle cells. VDAC2 but not VDAC3 protein could be identified in oocytes. Although gene expression was demonstrated for VDAC3, no VDAC3 protein could be detected in the marmoset ovary using immunohistochemical methods.

For further investigations for the determination of sub cellular distribution of the VDAC-proteins in isolated bovine oocytes immunocytochemical studies and confocal microscopy was performed. The results are in agreement with those obtained by conventional immunohistochemistry. At the protein level only VDAC1 and VDAC3 could be detected. VDAC1 was found in both, in the plasma membrane and in the ooplasma. VDAC3 was exclusively identified in the ooplasm.

In order to evaluate the physiological relevance of VDAC epitopes, functional studies, in particular concerning the „Regulatory Volume Decrease“ (RVD), were performed with bovine oocytes. The cells were challenged with hypotonic stimulation and subtype specific anti-VDAC-antibodies were used. Prior to hypotonic stimulation the oocytes were incubated or injected with the specific anti-VDAC-antibodies. Incubation of oocytes with anti-VDAC1- or with anti-VDAC2-antibodies did not influence the capacity of bovine oocytes to recover from hypotonic stimulation.

However, oocytes injected with anti-VDAC2-antibodies or treated (injected and incubated) with anti-VDAC3-antibodies showed a tendency of a delayed recovery from hypotonic challenge. The results obtained and data from literature suggest that the interaction of VDAC with components of the cytosceleton could be responsible for the regulation of bovine oocyte RVD. However, further studies need to be performed to strengthen this hypothesis.

The data presented in this thesis concerning synthesis, localization und function of VDAC proteins in bovine and Callithrix jacchus ovaries could be the basis for further scientific investigations (e.g. physiological relevance of VDAC protein in the reproduction of mammals). However, so far unsolved questions in daily medical practice could also be answered leading to the improvement of oocyte in vitro fertilization. Thus, the results obtained could be important for practitioners in veterinarian and human medicine as well as for the general understanding of the biology of reproduction.