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Translocation proteomics : a novel proteomic approach for the identification of signalling intermediates

Translokations-Proteomik : eine neue proteomische Methode zur Identifizierung von Signalmolekülen

Milosevic, Jadranka


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Department of Internal Medicine
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.04.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 27.06.2008
Kurzfassung auf Englisch: Members of the transforming growth factor (TGF)-beta superfamily are key
regulators of lung development and homeostasis, as well as alveolar epithelial cell
function. TGF-beta signalling involves ligand-dependent phosphorylation of receptor
serine/threonine kinases, phosphorylation of pathway-specific transcription factors
(Smads), nuclear translocation of Smads, and ultimately, modulation of gene
expression. Although Smad-dependent responses represent the primary signalling
system activated by TGF-beta receptors, alternative signalling systems have recently
been described, which also mediated TGF-beta-induced effects. In this study, a
proteomic approach was employed to identify: a) candidate proteins that are subjected
to nuclear-cytoplasmic shuttling in response to TGF-beta stimulation and b) novel
proteins phosphorylated within TGF-beta signaling pathway. In order to reduce
complexity of the total proteome subcellular fractionation and phosphoproteome
enrichment of A549 cells had been performed. Cytoplasmic, nuclear, and
phosphoprotein enriched fractions were subjected to two dimensional polyacrylamide
gel electrophoresis, tryptic digestion, and mass spectrometry in order to identify novel
candidates/mediators of the TGF-beta signaling pathway. In the first part of this study, a
rapid increase of KHRSP, FUBP1, hnRNP-L, and hnRNP-H1 localization in the
cytosol of A549 cells was observed, concomitant with a decrease in their nuclear
localization after TGF-beta stimulation. Proteomic data were confirmed by
immunofluorescence and immunoblotting analyses. In the second part of this study,
25 phosphoproteins were identified after TGF-beta stimulation, 20 of them with different
phosphorylation pattern in 2-DE and 5 of them without changes after TGF-beta
stimulation. In conclusion, we showed that proteomic approach can be used for
detecting novel intermediate proteins in signalling pathways and that regulatory
functions of TGF-beta signalling are broader than previously thought.
Kurzfassung auf Deutsch: Mitglieder der TGF-beta Familie stellen Schlüsselfaktoren für die Entwicklung und Homöostase der Lunge dar, sowie für die Funktion des alveolären Epithels. Die TGF-beta Signalkaskade erfolgt durch ligandenabhängige Phosphorylierung von Rezeptor Serin/Threoninkinasen, anschließende Phosporylierung von spezifischen Transkriptionsfaktoren (Smads), die Translokation der Smads in den Nukleus und schließlich die Regulierung der Genexpression. Obwohl die smadabhängige Signaltransduktion das primäre Signalsystem darstellt, das durch TGF-beta Rezeptoren aktiviert wird, wurden kürzlich auch andere Signalsysteme beschrieben, die ebenfalls durch TGF-beta induzierte Effekte vermitteln. In der vorliegenden Studie nutzten wir einen proteomischen Ansatz um a) mögliche Proteine zu identifizieren, die als Reaktion auf TGF-beta-Stimulation zwischen dem Nukleus und dem Zytoplasma pendeln und b) neue Proteine zu finden, die durch den TGF-beta Signalweg phosphoryliert werden. Um die Komplexität des Proteoms zu reduzieren wurde eine subzelluläre Fraktionierung und eine Anreicherung der Phosphoproteine von A549 Zellen durchgeführt. Mit den zytoplasmatischen, den nukleären und den Phosphoproteinfraktionen wurden jeweils zweidimensionale Polyacrylamid Gelelektrophoresen durchgeführt, anschließend eine Verdauung durch Trypsin und schließlich wurden mit Hilfe von Massenspektrometrie neue Kandidaten bzw. Mediatoren des TGF-beta Signalweges identifiziert. Im ersten Teil der Studie wurde nach der TGF-beta Stimulation ein rapider Anstieg von KHRSP, FUBP1, hnRNP-L und hnRNP-H1 im Zytosol der A549 Zellen beobachtet, einhergehend mit einer Abnahme dieser Proteine im Zellkern. Diese Daten wurden mit Hilfe von Immunfluoreszenz und Immunblots bestätigt. Im zweiten Teil der Studie wurden nach TGF-beta
Stimulation 25 Phosphoproteine identifiziert, von denen 20 ein verändertes Phosphorylierungsmuster in der 2 dimensionalen Gelelektrophorese aufwiesen und 5 Proteine keine Veränderung zeigten. Insgesamt zeigten wir, dass ein proteomischer Ansatz geeignet ist, um neue vermittelnde Proteine in Signaltransduktionswegen zu identifizieren und dass die regulatorischen Funktionen des TGF-beta Signalweges umfassender sind als bisher angenommen.