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URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2008/5867/


Einfluss von Eimeria bovis auf die Apoptosefähigkeit der Wirtszelle in vitro

Lang, Mirjam


Originalveröffentlichung: (2008) Giessen : VVB Laufersweiler 2008
pdf-Format: Dokument 1.pdf (4.638 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Parasitologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5271-3
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.04.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 21.05.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Eimeria bovis-Sporozoiten entwickelt sich in vivo in Endothelzellen und in vitro in mehreren bovinen Zelllinien in einem Zeitraum von 2-3 Wochen zum Meronten I, dem sog. Makromeronten. Dies setzt ein entsprechendes Überleben der Wirtszelle voraus. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des Parasiten auf die Apoptosefähigkeit seiner Wirtszelle in vitro untersucht.

Für die Untersuchungen wurden Endothelzellen aus bovinen Umbilikalvenen (BUVEC), eine immortalisierten Zelllinie aus bovinen fetalen Gastrointestinalzellen (BFGC) und Vero-Zellen als Wirtszellen eingesetzt. In allen Fällen wurden geschlossene Zellrasen verwendet. Die Infektion erfolgte mit 2,5 x 104 Sporozoiten/cm2 Zellrasen. Die Befallsrate betrug gewöhnlich 30-40 %. BUVEC und BFGC erlaubten nach Infektion mit Sporozoiten die Entwicklung reifer Meronten mit einer großen Anzahl von Merozoiten innerhalb von 3 Wochen. In infizierten Vero-Zellen kam es nicht zur Weiterentwicklung der Sporozoiten, doch persistierten die Parasiten innerhalb von großen parasitophoren Vakuolen über einen Zeitraum > 3 Wochen.

Bei infizierten BUVEC-Zellrasen überlebten infizierte Zellen über einen Beobachtungszeitraum von ca. 21 Tagen bis hin zur Merozoitenfreisetzung. Ab dem 10. Tag p. i. gingen nicht infizierte Zellen in die Apoptose; letztlich war die Mehrzahl dieser Zellen betroffen. Mit zunehmender Dauer der Kultivierung wuchsen aber wieder nicht infizierte Zellen aus, sodass sich zum Teil erneut intakte Zellrasen bildeten. Auch infizierte BFGC und Vero-Zellen überlebten den Untersuchungszeitraum, doch kam es nicht zur spontanen Apoptose nicht infizierter Zellen.

In der Folge wurde geprüft, ob E. bovis-Infektionen Wirtszellen auch gegen experimentell gesetzte Apoptosereize schützen. Als Wirtszellen dienten hierbei BFGC und Vero-Zellen. Als Apoptoseinduktoren fanden Actinomycin D, Cytochalasin B und Colchicin Verwendung. In einleitenden Versuchen wurden für die Induktoren die Konzentrationen festgelegt, die bei den Zelllinien etwa 50 % der Zellen apoptotisch werden ließen. Vero-Zellen erwiesen sich als wesentlich resistenter als BFGC.

Anschließende lichtmikroskopische Studien und Untersuchungen mittels TUNEL-Assay zeigten, dass eine E. bovis-Infektion spätestens 48 h p. i. die Wirtszelle vor dem Effekt der Apoptoseinduktoren schützt. Diesbezüglich bestand zwischen den Induktoren kein Unterschied. Zu früheren Zeitpunkten p. i. ist keine Aussage möglich, da dann die Applikation der Induktoren von einem Egress der Sporozoiten gefolgt war.

Versuche, das Ausmaß der induzierbaren Apoptose anhand der Expression von Annexin V, Caspase 3 oder Cytochrom-c mittels Durchflusszytometrie und Auszählung der Zellen, bzw. Fluoroscan oder ELISA zu bestimmen, schlugen fehl. Offensichtlich waren die erreichbaren Befallsraten in einer Gesamtpopulation von Zellen aus einem Zellrasen zu gering, um entsprechende Unterschiede erfassen zu können.

Um die Mechanismen der Apoptoseinhibition durch E. bovis zu erfassen, wurde in konfokalmikroskopischen Studien die Expression der zelleigenen Apoptoseinhibitoren „cellular inhibitor of apopoptosis protein1“ (c-IAP1), „cellular Flice inhibitory protein“ (c-FLIP) und „B-cell-lymphoma-2“ (Bcl-2) in infizierten und nicht infizierten BFGC in Reaktion auf Colchicin überprüft. Es zeigte sich, dass unter dem Einfluss des Induktors in infizierten Zellen c-IAP1 und c-FLIP signifikant stärker exprimiert wurden als in nicht infizierten Zellen. Somit wurde der Nachweis erbracht, dass E bovis-Sporozoiten sowohl den rezeptorvermittelten Weg der Apoptose (c-FLIP) beeinflussen können, als auch durch eine verstärkte Expression von c-IAP1 in der Wirtszelle die Caspase 9 und die Effektorcaspase 3 blockieren, um damit zentral in den Ablauf der Apoptose einzugreifen. Im Falle von c-IAP1 betraf die erhöhte Expression auch parasitenfreie Zellen in unmittelbarer Nachbarschaft infizierter Zellen. Hierin wurde ein Hinweis auf parakrine Effekte gesehen. Der Nachweis von Bcl-2 konnte nicht erbracht werden, offensichtlich, weil der zu Verfügung stehende heterologe Antikörper nicht ausreichend kreuzreagierte.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass E. bovis die Fähigkeit seiner Wirtszelle zur Apoptose beeinträchtigt und so seine lang andauernde Entwicklung zum Meronten sichert.
Kurzfassung auf Englisch: Eimeria bovis sporozoites develop in vivo in endothelial cells and in vitro in several bovine cell types within 2-3 weeks to 1st generation meronts, so-called macromeronts. The precondition for this development is on corresponding survival of the host cell. The current study was undertaken to investigate in vitro whether E. bovis interferes with the ability of a host cell to undergo apoptosis.

Three different cell types were employed: (i) Bovine umbilical vein cells (BFGC), (ii) immortalized bovine foetal gastrointestinal cells (BFGC) and (iii) Vero-cells. In all cases closed cell layers were used. Cell layers were infected with 2.5 x 104 sporozoites/cm2. Usually 30-40 % of the cells were infected. BUVEC and BFGC allow the complete maturation of 1st generation meronts; Vero-cells become invaded by sporozoites, however, the parasites do not develop further although they survive for > 3 weeks in large parasitophorous vacuoles.

Infected BUVEC survived the observation period of 3 weeks up to the release of merozoites. Beginning 10 days p. i., uninfected cells of the cell layer underwent apoptosis and finally most of them were concerned. With increasing time of infection, however, non infected cells proliferated anew. Infected BFGC and Vero-cells survived throughout the observation period as well, but there was no apoptosis in uninfected cells.

To investigate whether infected BFGC and Vero-cells resist artificially induced apoptosis, they were exposed to actinomycin D, cytochalasin B and colchicine as inducers of apoptosis. Initial experiments with uninfected cells revealed markedly higher resistance of Vero-cells compared to BFGC. Light microscopic investigation and TUNEL-assay studies showed, that E. bovis protects its host cells from effects of apoptosis inducers at the latest 48 h p. i. There was no difference between the inducer compounds. An earlier effect could not be checked because treatment of infected cell layers early after infection provoked the sporozoites to egress from the host cell.

Attempts to determine apoptosis rates in infected cell layers with the expression of Annexin V, Caspase 3 and cytochrome-c by flow cytometry, flouroscan techniques and ELISA failed. The probable reason is seen in an insufficient infection rate within a cell layer.

Confocal microscopy showed that infected, colchicine-challenged BFGC overexpress „cellular inhibitor of apoptosis protein1“ (c-IAP1) and „cellular Flice inhibitory protein“ (c-FLIP) when compared to parasite free cells. The strong expression of c-IAP1 in infected cells E. bovis suggests a central influence in the host cell apoptosis by blocking the effector caspase 3 and caspase 9. C-FLIP in E. bovis- infected cells proves that the parasite also inhibits the receptor pathway of apoptosis. In case of c-IAP1 even non infected cells in the direct neighbourhood of infected cells showed over expression, points at paracrine effects. Attempts to demonstrate Bcl-2 failed, probably due to insufficient cross-reactivity of the heterologous antibody employed.

In conclusion, the study shows that E bovis interferes with the ability of its host cell to undergo apoptosis, probably to ensure its own development to 1st generation meronts.