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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-56525
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2008/5652/


Gene expression of the testis-specific histone (H1t) in the spermatogenesis of the stallion

Oliveira Cavalcanti, Márcia Cristina


Originalveröffentlichung: (2008) Giessen : VVB Laufersweiler 2008
pdf-Format: Dokument 1.pdf (3.551 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und -Embryologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5262-1
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.02.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 07.04.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Die Sequenz des H1t Gens der Spezies Maus, Ratte, Affe und Mensch ist bereits bekannt. Beim Pferd war die H1t Sequenz bisher unbekannt. Durch Bioinformatikanalysen wurden Primer aus dem mit Maus, Ratte, Affe und Mensch größten homologen Bereich des H1t ausgewählt. Aus equinem Hodenhomogenat wurde eine Nested PCR durchgeführt, das Produkt sequenziert und anschließend kloniert. Die partielle H1t Sequenz des Pferdes ist in der Genbank eingetragen (Accession AJ865320). Die mRNA Expression konnte durch Reverse Transkriptase PCR (RT- PCR) in Hodenhomogenaten sowie durch eine Digoxigenin-markierte H1t-mRNA Sonde mittels In-situ Hybridisierung an Paraffinschnitten nachgewiesen werden. Es hat sich gezeigt, dass in der normalen Spermatogenese H1t mRNA in spermatogonien and in frühen bis mittleren pachytänen Spermatozyten exprimiert wird. Aus einer Protein-Protein-Sequenz Homologie (ClustalW http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) zwischen Maus, Ratte, Affe und Mensch wurde aus dem nicht konservierten Bereich eine Sequenz ausgesucht, um einen polyklonalen Antikörper herstellen zu lassen. Das H1t Protein ist durch Western Blot in der normalen Spermatogenese am Hodenhomogenat mit Hilfe eines polyklonalen Antikörpers gegen H1t Peptid LITEALSVSQER identifiziert und sequenziert worden (Peptidmassen – Fingerprint – Analyse mit MALDI – MS/MS). Das Protein hat ein Molekulargewicht von 29 kDa. In einem Expressionsprofil mit verschiedenen equinen Organen wurde festgestellt, dass H1t hodenspezifisch ist.

Im kryptorchiden Hoden zeigt das Keimepithel verschiedene Entwicklungsstadien der Keimzellen, die mit dem einen fetalen Hoden vergleichbar sind. Es handelt sich hier um Tubuli, in denen nur fetale Präspermatogonien und Spermatogonien vom Typ A vorhanden sind. Im präpubertären Hoden kann man Tubuli mit Keimzellen bis zur Stufe der frühen pachytänen Spermatozyten beobachten. Zum Nachweis des H1t Proteins wurde ein Western Blot durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Proteinexpression im Hodenhomogenat mit normaler Spermatogenese sehr stark ist. Dagegen gibt es kein Signal im Hodenhomogenat mit einem Arrest der Spermatogenese auf der Stufe von Spermatogonien in kryptorchiden Hoden. Im präpubertären Hoden konnte die Expression des H1t Proteins in frühen Spermatozyten nachgewiesen werden. Die Immunhistochemie zeigt in adulten Tieren ein starkes Signal im Zellkern von Primärspermatozyten bis hin zu runden Spermatiden. Um diese Ergebnisse auf mRNA Ebene quantitativ nachzuweisen, wurde eine Real-Time PCR durchgeführt. Die H1t mRNA wird in frühen Spermatozyten hochreguliert. Die bisherigen Daten zeigen, dass ebenso wie bei der Maus, das equine H1t auf RNA Ebene in geringen Mengen bereits in Präspermatogonien exprimiert und mit dem Beginn der Meiose hochreguliert wird. Bezüglich der Subfertilität des Hengstes wurde die Untersuchung mittels RT-PCR und Real Time PCR altersabhängig (≤ 2 Jahre und ≥ 3 Jahre) untersucht. Die Real-time RT-PCR zeigte eine Zunahme der H1t mRNA Expression in einem großen Bereich individueller Variabilität zwischen drei und vier Jahre alten Tiere und eine stabile Expression bei Tieren, die älter als vier Jahre sind. Das H1t Protein wurde in Hoden mit der Initiierung der Spermatogenese und dem Erscheinen von primären Spermatozyten durch Western Blot detektiert. Die Zell-Proteinexpression mittels Immunhistochemie hat eine Verlängerung der H1t Proteinexpression in präpubertären Hoden von zwei Jahre alten Tieren ergeben. Diese Studien deuten darauf hin, dass zwischen der H1t Geneexpression und der "Subfertilität" während der Spermatogenese des Hengstes ein Zusammenhang besteht.
Kurzfassung auf Englisch: The H1t gene is already known in several species such as mice, rat, monkey and human. In stallion, this gene was unknown so far. By means of bioinformatic analysis, were found an oligonucleotide from the same gene domain in this species. From equine testis homogenate a RT-PCR has been carried out. The product was sequenced and a fragment of equine H1t mRNA was cloned. This sequence was published in the GenBank (Accession no. AJ865320). The reverse transcriptase PCR together with in situ hybridization showed mRNA expression of H1t in all examined testes. H1t mRNA expression has been found in normal spermatogenesis in spermatogonia and primary spermatocytes up to mid pachytene. Ct value of Real-time RT-PCR showed that H1t mRNA is detected in testes containing spermatogenic development up to spermatogonia and in testes containing spermatogenic development up to mid pachytene spermatocytes. From protein-protein sequence homology (ClustalW http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) between mice, rat, monkey and human, it was possible to generate a polyclonal antibody.
The H1t protein was detected by Western Blot at 29 kDa using a polyclonal antibody specifically detecting the peptide LITEALSVSQER. The protein was identified and sequenced by fingerprint analysis with MALDI-MS/MS. By means of expression profile analysis with different equine organs, it could be demonstrated, that the detected H1t is testis specific. The H1t protein was first detected in prepubertal testes of one year old animals with initiation of spermatogenesis and the occurrence of primary spermatocytes, while testes containing only prespermatogonia/spermatogonia were negative. In testes of adult stallions, immunohistochemistry showed a strong signal in nuclei of primary spermatocytes up to round spermatids. Concerning the sub fertility of younger stallions, H1t mRNA expression was detected in all animals with different ages and spermatogenic development. Analyses of testes at different ages (≤ 2 years and ≥ 3 years) by Real-Time RT-PCR revealed an increase of H1t mRNA expression with a wide range of individual variety between 3 - 4 years old animals indicating a stable expression in animals not before 4 years old. By in situ hybridization, no differences between pubertal and adult testes could be found. The H1t protein was only detected in testes showing primary spermatocytes. In addition, in peripubertal animals immunohistochemistry showed a prolonged expression of H1t protein that persists until elongated spermatids suggesting an impaired in nuclear protein exchange that could lead to an abnormal chromatin condensation. These data suggest the involvement of H1t gene expression in the well-known premature subfertility the stallion.