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Investigation of the role of PKC-alpha for influenza A virus-induced signalling and of the inhibitory effect of Verapamil on virus replication

Untersuchungen zur Rolle von PKC-alpha für die Influenza-A-Virus induzierte

Alam, Mohammad Intakhab


Originalveröffentlichung: (2007) J. Biol. Chem., Vol. 281, 2006, 24, p. 16707-16715
pdf-Format: Dokument 1.pdf (4.513 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Virologie , Microbiologie , Biochemie
Freie Schlagwörter (Englisch): Virology , Microbiology , Biochemistry
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institute for Medical Virology
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.02.2008
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 26.02.2008
Kurzfassung auf Englisch: Influenza Virus (IV) activates the Raf/MEK/ERK-(MAPK) cascade late in their
replication cycle. This is essential for efficient nuclear RNP-export and therefore for
production of infectious IV. To characterize cellular factors involved in MAPKactivation
in the context of the viral infection I recently analyzed the role of PKC-alpha. The
results so far indicate, that activation of the Ca2+ activated PKC-alpha is involved in the IV
induced MAPK-signaling and that specific inhibition of this function using a Ca2+
channel blocker (Verapamil) at non toxic concentration, negatively affects IV
propagation (265). In addition, I have now further analyzed the action of Verapamil for
possible additional negative effects on IV replication. Therefore I have investigated
viral protein production in IV infected human lung epithelial cell line A549 and found
that PB1, NP, and NS1 production is significantly reduced in IV infected and
Verapamil treated A549 cells. Cell survival and cellular protein production does not
seem to be affected ruling out a general effect of Verapamil on translation. Since PB1 is
a functional important subunit of the viral polymerase the activity of the polymerase
might be affected. Therefore I analyzed the polymerase activity in Verapamil treated
cells for the production of viral mRNA using primer extension analysis of a reporter
transcript expressed by either a plasmid based replication system or in virus infected
cells.


My current results show that viral mRNA production in the plasmid based replication
system is not affected, while it seems to be reduced in virus infected cells. This
indicates that Verapamil might alter viral transcription activity in virus infected cells.
Taken together, PKC-alpha plays an important role in transmitting the influenza virus
induced signal to the MAPK-cascade. As this PKC-alpha inhibition can be achieved at nontoxic
Verapamil concentration, leading to strong reduction of virus titers, inhibition of
this cellular activity might be a potential anti-viral therapy.
Kurzfassung auf Deutsch: Influenzaviren (IV) aktivieren die Raf/MEK/ERK (MAPK)-
Signaltransduktionskaskade in der späten Phase ihres Replikationszyklus. Dies ist
essentiell für einen effizienten RNP-Kernexport und damit für die Produktion
infektiöser Viren. Zur Charakterisierung zellulärer Faktoren, welche im Kontext der
viralen Infektion die MAPK-Kaskade aktivieren, habe ich die Rolle von PKC-alpha
analysiert. Die bisherigen Ergebnisse zeigen, daß die Aktivierung der Ca2+-aktivierten
PKC-alpha an der virusinduzierten MAPK-Aktivität beteiligt ist, und das die Inhibition
dieser Funktion durch einen Ca2+-Kanalblocker (Verapamil) in nicht toxischen
Konzentrationen die IV-Vermehrung negativ beeinflußt (265). Zusätzlich habe ich
weitere negative Effekte der Wirkung von Verapamil auf die IV-Vermehrung
untersucht. Dafür habe ich die Produktion viraler Proteine in der IV-infizierten
humanen Lungenalveolar-Epithelzellinie A549 analysiert. Dabei konnte ich zeigen, daß
die Expression von PB1, NP und NS1 in infizierten und Verapamil-behandelten A549-
Zellen signifikant reduziert ist. Dabei führt die Verapamil-Behandlung nicht generell zu
einer Beeinträchtigung des Zellüberlebens oder einer verringerten
Zellproteinproduktion. Da PB1 eine funktionell wichtige Untereinheit der viralen RNAabhängigen
RNA-Polymerase (RDRP) ist, könnte die RDRP beeinflußt sein. Deshalb
untersuchte ich die Produktion viraler mRNA. Zum einen in transfizierten A549-Zellen
in denen mittels eines plasmidgestützen Replikationssystem zur transienten Expression
viraler RDRP und eines vRNA-ähnlichen Pol1-Transkriopts virale mRNA gebildet
wurde. Zum anderen wurde in transfizierten Zellen nur das vRNA-ähnliche Pol1-
Trankript gebildet, welches dann durch die RDRP-Aktivität nach IV-Infektion der
transfizierten Zellen repliziert und transkribiert wurde. Die jetzigen Ergebnisse der
„Primer-Extension“-Analyse zeigen, daß die Produktion viralen mRNA in dem
plasmidgestützten system nicht beeinflußt zu sein scheint, aber in den IV-infizierten
Zellen. Das könnte bedeuten, daß Verapamil die virale Transkription in virusinfizierten
Zellen beeinträchtigt. Zusammengefaßt kann man sagen, daß PKC-alpha eine wichtige Rolle
in der Signaltransmission der IV-induzierten MAPK-Kaskade spielt. Da Verapamil in
nicht toxischen Konzentrationen PKC-alpha inhibiert, die IV-Vermehrung hemmt und
Verapamil als Pharmazeutika zugelassen ist, könnte Verapamil für einen anti-viralen
therapeutischen Ansatz gegen IV nützlich sein.