Im Western Blot wurden Translationsprodukte sowohl ganzer Länge sowie kürzere Formen von CREM-Theta2-F-G-H-Ib nachgewiesen, wohingegen von CREM-Theta2-G-H-Ib nur Proteine gebildet wurden, bei denen die Translation erst in Exon G beginnt. Eine spezifische Bindung der Proteine an die DNA konnte bei allen Proben, die CREM-Translationsprodukte enthielten, mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay nachgewiesen werden. Die Luziferase-Reportergen-Analyse zeigte, dass die pcDNA/cBeta abhängige Aktivierung des Reportergenkonstrukts bei CREM-Theta2-F-G-H-Ib, nicht jedoch bei CREM-Theta2-G-H-Ib signifikant inhibiert wurde und weist somit auf eine überwiegende Repressorfunktion der von CREM-Theta2-F-G-H-Ib kodierten Proteine hin. Die transkriptionale Aktivität von CREM-Theta2-G-H-Ib konnte nicht eindeutig ermittelt werden. ">
 

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Funktionelle Charakterisierung von CREM-Isoformen in männlichen Keimzellen

Jaspers gen. Bünger, Saskia


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und -Embryologie; Klinik für Urologie und Kinderurologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.12.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 13.03.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Während der Spermatogenese ist für die terminale Differenzierung befruchtungsfähiger Spermien die korrekte sequentielle Genexpression in den Keimzellen eine conditio sine qua non. Zur Regulation der mRNA-Expression in Spermatiden kommt dem Transkriptionsfaktor cAMP responsive element modulator (CREM) eine besondere Bedeutung zu. Nach Bindung von spezifischen CREM-Isoformen an ein cAMP responsive element (CRE) in der Promotorregion von Zielgenen kann die Transkription über den cAMP Signaltransduktionsweg beeinflusst und die Genexpression in männlichen Keimzellen reguliert werden. Die essentielle Bedeutung von CREM für die Spermatogenese wird bei Mäusen deutlich, bei denen das CREM-Gen inaktiviert wurde. Sie waren nicht fortpflanzungsfähig und ihre Spermatogenese vollzog sich lediglich bis zum Stadium der runden Spermatiden. Bei Männern mit einem Spermatidenreifungsdefekt kam es nicht zur vollständigen Ausdifferenzierung der Spermatiden, die CREM Expression war hier drastisch vermindert.

Durch Mechanismen wie alternative Promotorverwendung, alternatives Exonspleißen und alternative Translationsinitiation entstehen bei der CREM-Genexpression funktionell unterschiedliche CREM-Proteine mit aktivierendem oder reprimierendem Potential auf die Zielgenexpression. Für die beiden Isoformen Theta2-F-G-H-Ib und Theta2-G-H-Ib erfolgte die funktionelle Zuordnung "Repressor" bisher ausschließlich auf Grund der Exonzusammensetzung der Transkripte, d.h. auf mRNA-Ebene. Dadurch, dass in diesen beiden Isoformen Exon Theta2 direkt an Exon F respektive G gespleißt ist, kommt es zu einer Unterbrechung des bekannten Leserasters. Ziel dieser Untersuchung war es zu klären, ob von den CREM-mRNA Isoformen Theta2-F-G-H-Ib und Theta2-G-H-Ib Proteine translatiert werden, ob diese Proteine dann in-vitro sequenzspezifisch an die DNA binden können und ob sie funktionell als transkriptionale Aktivatoren oder Repressoren fungieren.

Im Western Blot wurden Translationsprodukte sowohl ganzer Länge sowie kürzere Formen von CREM-Theta2-F-G-H-Ib nachgewiesen, wohingegen von CREM-Theta2-G-H-Ib nur Proteine gebildet wurden, bei denen die Translation erst in Exon G beginnt. Eine spezifische Bindung der Proteine an die DNA konnte bei allen Proben, die CREM-Translationsprodukte enthielten, mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay nachgewiesen werden. Die Luziferase-Reportergen-Analyse zeigte, dass die pcDNA/cBeta abhängige Aktivierung des Reportergenkonstrukts bei CREM-Theta2-F-G-H-Ib, nicht jedoch bei CREM-Theta2-G-H-Ib signifikant inhibiert wurde und weist somit auf eine überwiegende Repressorfunktion der von CREM-Theta2-F-G-H-Ib kodierten Proteine hin. Die transkriptionale Aktivität von CREM-Theta2-G-H-Ib konnte nicht eindeutig ermittelt werden.
Kurzfassung auf Englisch: During the process of spermiogenesis the correct sequential gene expression in germ cells is indispensible for the terminal differentiation of fertile sperm. For the regulation of mRNA expression in spermatids the transcription factor cAMP responsive element modulator (CREM) is of great significance. After binding of specific CREM-isoforms to a cAMP responsive element (CRE) in the promoter region of target genes transcription can be modulated via cAMP signal transduction pathway and gene expression in male germ cells can be regulated. The significance of CREM for spermatogenesis becomes obvious in mice in which the CREM gene was inactivated. They were not able to reproduce and their spermatogenesis only proceeded to the stage of round spermatids. In men with a spermatid maturation arrest spermatids failed to differenciate completely, CREM expression was drastically reduced.

Due to alternative promoter usage, alternative splicing and alternative translation initiation, expression of the CREM gene results in the production of functionally different CREM proteins with either activating or repressing potential on target gene expression. For the isoforms theta2-F-G-H-Ib and theta2-G-H-Ib functional classification "repressor" occured solely on the base of the exon composition of the transcripts i. e. on the mRNA-level. Due to the fact that in both isoforms exon theta2 is directly spliced to exon F and G respectively the known open reading frame is disrupted. The aim of this study was to find out if proteins are translated from CREM-mRNA isoforms theta2-F-G-H-Ib and theta2-G-H-Ib, if these proteins are able to specifically bind to DNA and if they function as transcriptional activators or repressors. Full length translation products as well as shorter forms from CREM-theta2-F-G-H-Ib were detected in western blotting whereas CREM-theta2-G-H-Ib only gave rise to proteins with translation initiation in exon G. Sequence-specific DNA-binding ability was observed with all samples containing CREM-translation products in electrophoretic mobility shift assays. Chemiluminescent luciferase assays showed that pcDNA/cbeta dependent activation of the reporter gene construct was inhibited significantly by CREM-theta2-F-G-H-Ib but not by CREM-theta2-G-H-Ib and therefore points to a predominant repressor function of CREM-theta2-F-G-H-Ib coded proteins. The transcriptional activity of CREM-theta2-G-H-Ib could not be determined exactly.