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URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2008/5456/


Tryptophan-abhängige Pigmentsynthese bei Brandpilzen

Mayer, Peter Karl


pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.203 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Pigmentsynthese , Tryptophan , Brandpilze
Freie Schlagwörter (Englisch): Pigmentogenesis , smut pungi , tryptophan
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Zentrum für Dermatologie und Andrologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 12.02.2008
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 15.02.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Im Jahre 1998 konnten MAYSER ET AL. erstmals nachweisen, dass die Aminosäure L-Tryptophan bei dem Brandpilz Malassezia furfur eine Pigmentbildung induziert. Die entstandenen Pigmente und Fluorochrome werden mit dem Krankheitsbild der Pityriasis versicolor in Verbindung gebracht. Im Gegensatz zu Malassezia furfur sind Brandpilze obligate Pflanzenparasiten. Aufgrund der phylogenetischen Klassifikation von Malassezia furfur als Brandpilz wurden insgesamt 27 Brandpilze auf Pigmentbildung untersucht und miteinander verglichen. Zunächst wurden alle Spezies auf einem, um Glucose erweiterten Minimalagar mit Tryptophan als einziger Stickstoffquelle verimpft und sowohl Wachstum als auch Pigmentbildung beobachtet.
Es konnte erstmals gezeigt werden, dass außer Malassezia furfur auch andere Brandpilze in der Lage sind, Tryptophan-abhängige Pigmentbildung durchzuführen. Von den hier untersuchten 27 Brandpilzen konnten 17 Spezies zur Pigmentbildung auf Tryptophan-Agar angeregt werden. Alle als Pigment-positiv getesteten Spezies wurden nachgezüchtet und präparativ aufbereitet. Der gewonnene Rohextrakt wurde mittels Säulenchromatographie aufgereinigt und in Fraktionen unterteilt. Anschließend wurden die gewonnenen Fraktionen mittels Dünnschicht-chromatographie näher untersucht. Die Dünnschichtchromatogramme der einzelnen Pilzspezies zeigten unterschiedliche, spezifische Pigmentmuster. Um die Dünnschichtchromatogramme miteinander zu vergleichen, wurde für alle Pilze ein Pigmentprofil erstellt, in dem die Banden durch Farbe bei Tages- und unter UV-Licht sowie Laufhöhe und Fraktion der Banden und mögliche ph-Abhängigkeit beschrieben wurden. Einige Banden wurden durch weiterführende Verfahren weiterverarbeitet, aufgereinigt und anschließend eine Strukturaufklärung durchgeführt. Bei der Strukturanalyse konnten die Stoffe Pityriacitrin bei Ustilago maydis und Pseudozyma fusiformata, Pityriarubin B, Pityriarubin C und Pityriaanhydrid bei Ustilago maydis, sowie Malasseziaindol A, Indolmilchsäure und Indol-3-carbaldehyd bei Pseudozyma fusiformata nachgewiesen werden.

Um einen indirekten Nachweis einzelner Stoffe zu erhalten, wurden Fraktionen mit entsprechenden Banden nebeneinander aufgetragen und so direkt optisch miteinander verglichen. Häufig auftretende Laufhöhenschwankungen einzelner Banden konnten dadurch minimiert werden. Ein indirekter Nachweis des Lichtschutzes Pityriacitrin konnte hiermit bei allen Spezies erfolgen. Die Pityriarubine A, B und C, die den oxidativen Burst von Granulozyten hemmen, konnten ebenso bei nahezu allen Spezies gefunden werden. Um die gewonnen Informationen über die Pigmentmuster der einzelnen Spezies miteinander zu vergleichen, wurde der Versuch einer Datenanalyse unternommen. Es sollte hierbei eine Grundlage geschaffen werden, um die große Menge gewonnener Informationen vergleichbar zu machen und eine relative Vorhersagbarkeit für das Auftreten bestimmter Banden zu treffen. Es wurde für acht Banden das Schwankungsausmaß der Laufhöhen beschrieben und durch den neu eingeführten Parameter der relativen Höhe reduziert. Anschließend wurde die relative Vorhersagbarkeit bestimmter Banden anhand weiterer Pilzspezies überprüft. Die untersuchten Banden befanden sich in dem für sie vorgesehenen Bereich und konnten somit als solche identifiziert werden.

Dieses hier entwickelte Prinzip könnte einer in Zukunft automatisch mit Farbscannern durchgeführten Datenanalyse als Grundlage dienen.
Kurzfassung auf Englisch: In 1998 MAYSER ET AL. proved for the first time that the amino acid tryptophan induces pigmentogenesis in the yeast Malassezia furfur. The use of tryptophan as single nitrogen source induces formation of brown pigmentation which diffuses into the agar. Synthesis of fluorochromes and pigments in Malassezia furfur may have an impact on the clinical appearance of pityriasis versicolor. Phylogenetic placement of Ustilaginomycetes determines Malassezia furfur as a species of smut fungi. Unlike Malassezia furfur, smut fungi are parasites of plants, which rarely cause human disease. Since Malassezia furfur is phylogenetically connected with smut fungi, 27 species of smut fungi were explored and compared according to pigmentogenesis. First, all species were cultured on a minimal medium consisting of agar enriched with glucose in which tryptophan was the single nitrogen source. This research showed for the first time that not only human pathogens, but also plant pathogenic fungi are able to produce tryptophan-derived pigments. The 17 species that were tested pigment-positive were processed after 4 weeks of incubation. To obtain pure compounds from the pigment extract, the eluent was collected after column chromatography in six or seven series. The fractions were subsequently examined by thin layer chromatography, which revealed a specific pigment pattern. Both similarities and varieties were observed in structure, existence and intensity of colour of the bands. Bands and substances already known from Malassezia furfur were used as an orientation guide. For comparison of the individual thin layer chromatograms, a pigment profile was established for each fungus, in which the bands were described by colour at daylight and under UV as well as height, fraction and pH dependence. Some bands were analysed by further methods, and finally specific substances were structurally determined. Pityriacitrin was isolated from Ustilago maydis and Pseudozyma fusiformata. Pityriarubin B, C and Pityriaanhydride were isolated from Ustilago maydis as well as Malassezia indole A, indole lactic acid and indole-3-carbaldehyde from Pseudozyma fusiformata.

To get an indirect evidence of specific substances, fractions with corresponding bands were compared directly on one thin layer chromatogram, whereby variability in height of the band could be reduced impressively. An indirect evidence of the ultraviolet-absorbing indole alkaloid Pityriacitrin was supplied for each species. Pityriarubin A, B and C, which inhibit respiratory burst in human neutrophils, were found in most of the species. Because of the specificity of the pigment pattern all species were subdivided into four groups.

In order to make the individual pigment patterns of the fungi comparable to one another, an attempt was made to establish a data analysis. At first, height variabilities among the bands were investigated and reduced by the new parameter of relative height. This allowed predictability of certain bands, which was later verified on four other species. All the bands were found in the allocated space. In the future this method could be used for data analysis automatically done by colour scanners.