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URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2008/5233/


Hypoxie-induzierte Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in isoliert perfundierten und ventilierten Mauslungen

Hypoxia-induced formation of reactive oxygen species (ROS) in isolated perfused and ventilated mouse lungs

Schäfer, Rolf Ulrich


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Hypoxie , ROS , NADP(H)-Oxidase , Lunge
Freie Schlagwörter (Englisch): Hypoxia , ROS , NADP(H)-Oxidase , Lung
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Tierphysiologe; Lungenzentrum, Medizinische Klinik II/V
Fachgebiet: Biologie, Chemie und Geowissenschaften fachübergreifend
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.11.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 17.01.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Einleitung: Hypoxie induziert (patho-)physiologische Veränderungen in der Lunge. Unter akuter Hypoxie wird die Perfusion durch Konstriktion präkapillärer Gefäße an die regionalen Ventilationsverhältnisse in der Lunge angepasst. Zu pathophysiologischen Veränderungen der Lungenstrombahn kommt es unter chronischer Hypoxie. Unter diesen Bedingungen proliferieren und migrieren glatte Muskelzellen und Fibroblasten in die Gefäßmedia und führen zur Verdickung dieser Gefäßschicht, ein Vorgang der Remodeling genannt wird. Für beide Prozesse sollen reaktive Sauerstoffspezies als Signalmoleküle von ausschlaggebender Bedeutung sein. Das Ziel dieser Arbeit ist, die Rolle von ROS für die unter akuter und chronischer Hypoxie auftretenden Veränderungen der Lungenstrombahn zu klären und insbesondere die Beteiligung phagozytärer und nicht-phagozytärer NADP(H)-Oxidasen an der Superoxidproduktion (•O2-) zu untersuchen.

Methodik: Die •O2–Produktion wurde in isoliert perfundierten und ventilierten Mauslungen unter Verwendung des Spin Probes Hydroxy-Carboxy-Tetramethylpyrrolidine (CPH) mittels Elektronenspinresonanz Spektroskopie untersucht. Die Spezifität der Methode für Superoxid wurde in Parallelexperimenten durch Einsatz von Superoxiddismutase sichergestellt. NADP(H)-Oxidasen wurden durch Zugabe von Phorbol-Myristate-Acetat (PMA) stimuliert. Der Einfluss chronischer Hypoxie auf die ROS-Freisetzung wurde in Mäusen untersucht, die 21 Tage normobarisch in einer Atmosphäre mit vermindertem Sauerstoffgehalt (FiO2=0,10) gehalten wurden. Die ROS-Freisetzung bei akuter Hypoxie wurde in Experimenten mit wechselnd normoxischer und hypoxischer Beatmung untersucht. Um die Rolle von NADP(H)-Oxidasen zu evaluieren, kamen genveränderte Mäuse zum Einsatz, die entweder einen knockout der gp91phox oder p47phox Untereinheiten von NADP(H)-Oxidasen aufwiesen oder die p22phox Untereinheit überexprimierten. Um zwischen der ROS-Freisetzung aus phagozytären und nicht-phagozytären NADP(H)-Oxidasen unterscheiden zu können, wurden chimäre Mäuse eingesetzt.

Ergebnisse: Unter normoxischen Basisbedingungen konnte eine ROS-Freisetzung nach intravasal nachgewiesen werden, die nach Zugabe von PMA erhöht war. Die verwendeten knockout Tiere zeigten unter diesen Bedingungen keine ROS-Freisetzung, allerdings war diese durch Überexpression der p22phox Untereinheit von NADP(H)-Oxidasen erhöht. Chronisch hypoxische Tiere zeigten auch nach PMA-Stimulation keine •O2–Produktion, was sich ebenfalls unter akuter Hypoxie manifestierte. Mäuse mit einer Deletion der p47phox-Untereinheit setzten unter akuter Hypoxie vermehrt •O2- frei. In Versuchen mit chimären Mäusen wurden phagozytäre NADP(H)-Oxidasen als Hauptquelle der normoxischen Superoxidproduktion identifiziert.
Kurzfassung auf Englisch: Hypoxia induces (patho)physiological changes in the lung. Physiological matching of perfusion to ventilation occurs in acute hypoxia by constriction of precapillary vessels. Pathophysiological changes result in media hypertrophy (remodeling) by proliferation and migration of smooth muscle cells and fibroblasts driven by chronic hypoxia. For both processes, reactive oxygen species (ROS) are thought to play a pivotal role as signalling molecules. The aim of this study was to elucidate the role of ROS under acute and chronic hypoxia and non-phagocytic NADPH-oxidases (NOX) as possible source of lung superoxide (•O2-) release.

We investigated •O2- release in isolated perfused and ventilated mouse lungs using electron spin resonance spectroscopy with the spin probe hydroxy-carboxy-tetramethylpyrrolidine. Specificity for •O2- was assured in parallel experiments in the presence of superoxide dismutase. NOX were activated by phorbol-myristate-acetate. The impact of chronic hypoxia on ROS production in mouse lungs was investigated in mice kept for 21 days
under hypoxia (FiO2 = 0.10). We also investigated •O2- release in mice lacking the p47 or gp91 or overexpressing the p22 subunit of NOX. The source of •O2- was identified in chimeric mice.

Normoxically ventilated mouse lungs released •O2- under baseline conditions into the intravascular compartment. Mice show no •O2- release under baseline conditions after chronic hypoxia. Depletion of the p47 or gp91 subunit of NOX decreases •O2- release, but overexpression of the p22 subunit increases •O2- production in mouse lungs.

Mouse lungs release •O2- under normoxic conditions. This release is only partially dependent on the p47, but highly dependent on gp91 and p22 subunit of NADP(H)-oxidases. Trials with chimeras specify leukocytes being the primary source of normoxic •O2- production.