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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-50842
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2007/5084/


Molekularbiologischer Nachweis mutmaßlicher Virulenzfaktoren bei Staphylococcus aureus-Kulturen, isoliert von Rindermastitiden

Eissa, Nawara M. B.


Originalveröffentlichung: (2007) Giessen : VVB Laufersweiler 2007
pdf-Format: Dokument 1.pdf (3.279 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5210-2
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.10.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 16.11.2007
Kurzfassung auf Deutsch: In den vorliegenden Untersuchungen wurden insgesamt 325 präsumtiv identifizierte bovine S. aureus-Kulturen aus Viertelgemelksproben der Routinediagnostik des LHL, Gießen verwendet. Die Isolate stammten aus unterschiedlichen Regionen in Hessen aus Betrieben mit zum Teil hochgradigen Eutergesundheitsstörungen.

310 Stämme zeigten phänotypisch eine Hämolyse, 15 waren anhämolysierend.
Unter Verwendung verschiedener Genotypisierungsverfahren (Makrorestriktionsanalyse, coa-/spa-Gen-Polymorphismus) erfolgte unter den hämolysierenden Stämmen eine Auswahl von 61 genetisch differenten S. aureus-Isolaten für die weitergehenden Untersuchungen. Ergänzt wurden diese durch die 15 anhämolysierenden S. aureus-Kulturen.
Traten genotypisch identische S. aureus-Feldisolate in einem Betrieb mehrfach (≤ 6 Kulturen) bei verschiedenen Kühen auf, wurde das betreffende Isolat als „epidemisch“ gewertet. Nur vereinzelt auftretende Genotypen galten als „sporadisch“.

Alle 76 ausgewählten Feldstämme wurden nach eingehender kultureller, biochemischer und molekularbiologischer Speziesidentifizierung hinsichtlich mutmaßlicher Virulenzfaktorgene, wie z.B. Anheftungsfaktor-, Mikrokapsel-, Hämolysin- und weiterer Toxingene untersucht.

Zur Beurteilung des krankmachenden Potentials erfolgte eine Zuordnung der Zellzahl der Ursprungsviertelgemelksprobe zu Eigenschaften von jedem dieser ausgewählten S. aureus-Feldisolate (Viertel-Zellzahl), ebenso wie eine Zuordnung der durchschnittlichen Zellzahl der Viertelgemelksproben der untersuchten Viertel eines Betriebes, die positiv für die genotypisch identischen S. aureus-Isolate waren (Betriebs-Zellzahl).

Die anschließend durchgeführte explorativ-statistische Auswertung ergab signifikante Zusammenhänge zwischen dem epidemiologischen Verhalten und dem Auftreten der im egc-Gencluster zusammengefassten Enterotoxingene seg, sei, sem, sen und seo. Ebenso war das phänotypische Hämolyseverhalten statistisch signifikant mit dem Auftreten des egc-Genclusters verbunden. Bezüglich der genetischen Marker coa- und spa-Gen war die Repeat-Anzahl ebenfalls statistisch signifikant mit dem Auftreten des egc-Genclusters korreliert. Und schließlich ergab sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Zellzahl der Ursprungsviertelgemelksprobe und dem egc-Gencluster. Zusätzlich erwies sich der Zusammenhang zwischen Zellzahl und der Anzahl der spa-Gen-Repeats als statistisch signifikant.

Das Auftreten des sbi-Gens innerhalb der Gruppe der „sporadischen“ S. aureus-Kulturen erwies sich als hochsignifikant. Weitere Signifikanzen ergaben sich bei den „sporadische“ S. aureus gegenüber der Summe der Enterotoxin-, der Anheftungsfaktorgene und der Anzahl der spa-Repeats. Die Summe aller Virulenzfaktoren erwies sich ebenfalls als statistisch hochsignifikant.


Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass das egc-Gencluster und die Anzahl der spa-Gen-Repeats in der Pathogenese der durch S. aureus hervorgerufenen Mastitis offensichtlich eine Rolle spielen. Dabei scheint allgemein den phänotypisch beta-hämolysierenden Stämmen eine größere Bedeutung zuzukommen, da die betreffenden Feldstämme ein statistisch signifikant höheres Virulenzpotential aufwiesen. Auch die Anzahl an spa-Gen-Repeats könnte als genetischer Marker eingesetzt werden, da diese mit dem Auftreten verschiedener Virulenzgene positiv assoziiert sind.
Die in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen und Verfahren könnten die Auswahl des für das Eutergesundheitsproblem des Betriebes entscheidenden S. aureus-Stammes erleichtern und die Herstellung einer stallspezifischen Vakzine unterstützen.
Kurzfassung auf Englisch: In the present study 325 presumptively identified S. aureus-strains from routine diagnostic of bovine quarter-milk samples of LHL, Giessen were used. The isolates were obtained from farms all over Hessia, Germany, with partly severe mastitic problems.

310 strains were phenotypically hemolytic, 15 were non-hemolytic.
Using different methods of genotyping (PFGE analysis, coa/spa-gene polymorphism) among the hemolytic strains 61 genetically different S. aureus isolates were selected for further investigations. Additionally, the 15 non-hemolytic S. aureus-strains were used.

If genotypically identical S. aureus field-strains were found several times in different cows of one farm (≤ 6 cultures) these isolates were classified as “epidemic”. Single genotypes were called “sporadic”.
The species identity of the 76 field-strains was confirmed by cultural, biochemical and molecular methods. The 76 strains were additionally investigated for the presence of genes encoding potential virulence factors such as bindingproteins, microcapsule, hemolysins, and other toxins.

To evaluate the potential of causing sickness the properties of each of the selected S. aureus field-isolates was related to the number of somatic cells of the original quater-milk-sample as well as to the average cell count of all investigated quater-milk-samples of the same farm with genotypically identical S. aureus isolates.

In an additionally performed explorative-statistical evaluation significant correlations were found between epidemiological behaviour and the egc-gencluster (this is the gencluster with the combined enterotoxin genes seg, sei, sem, sen and seo). Furthermore there was a statistically significant correlation between the phenotypic property beta-hemolysis and the egc-gencluster. The number of repeats of the genetic marker “coa”- and “spa”-gene was statistically significant correlated with the egc-gencluster. In addition there was a significant correlation between cell count of the original quarter-milk sample and the egc-gencluster. Additionally the number of spa-repeats was statistically significant and the presence of sbi-gene was highly significant in the group of sporadic S. aureus. Further significant correlations were found in the total of the genes encoding enterotoxins, bindingproteins and the number of spa-repeats. The total of all virulence factors was statistically highly significant.

In summary it can be concluded that the presence of the egc-gencluster and the number of spa-gene-repeats has obviously an importance in the pathogenesis of mastitis caused by S. aureus. It appears that the presence of phenotypically β-hemolytic strains seems to be more important, as these field-strains had a significant higher virulence potential. The spa-gene-repeats can also be used as genetic markers as their number was positively associated with different virulence genes.
The results of the present study can help to select a S. aureus strain mainly involved in mastitic problems of a single farm. This strain could subsequently be used for production of a farm specific vaccine.