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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-48439
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2007/4843/


Molecular and cytological investigations of the fungal endophyte Piriformospora indica and its interactions with the crop plant barley

Deshmukh, Sachin D.


pdf-Format: Dokument 1.pdf (8.918 KB)

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Freie Schlagwörter (Englisch): biodiversity , mycorrhiza , rhizosphere , Sebacinales , systemic resistance
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Phytopathologie und Angewandte Zoologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.05.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 15.10.2007
Kurzfassung auf Englisch: Plant roots are potential hosts of a plethora of beneficial microorganisms including mycorrhizal fungi, rhizobial bacteria, and endophytic fungi of the newly defined order Sebacinales (Basidiomycota). The recently discovered root endophyte Piriformospora indica represents a model organism of this fungal order. The axenically cultivable P. indica colonizes roots of a large number of monocotyledonous and dicotyledonous plant species including cereals and Brassicaceae. The symbiosis is characterized by increased biomass and grain yield of interacting plants. In barley, the endophyte induces local and systemic resistance to fungal diseases and to abiotic stress. To further elucidate the lifestyle of P. indica, fungal development and host reactions were analyzed during the mutualistic symbiosis with barley roots. It was revealed that like other mutualistic endophytes, P. indica colonizes roots in an asymptomatic manner. The fungal colonization increases with root tissue maturation. The root tip meristem showed no colonization and the elongation zone showed mainly intercellular colonization. The differentiation zone was heavily infested by inter- and intracellular hyphae and intracellular chlamydospores. The majority of hyphae were present in intercellular spaces, dead rhizodermal and cortical cells that became completely filled with chlamydospores at later interaction stages. In some cases, hyphae penetrated cells and built a meshwork around plasmolyzed protoplasts, suggesting that the fungus either actively kills cells or senses cells undergoing endogenous programmed cell death. However, the expression of the barley BAX inhibitor-1 (HvBI-1) gene, an inhibitor of plant cell death, was suppressed during colonization. Consistently, fungal proliferation was strongly inhibited in transgenic barley lines overexpressing GFP-tagged HvBI-1. The cytological observations and responses of the host genetic factor to fungal infestation showed that P. indica requires host cell death for proliferation in differentiated barley roots and the endophyte interferes with the host cell death program to form a mutualistic interaction with plants.
Infection of plant roots with pathogenic necrotrophic fungi of the genus Fusarium leads to necrotized roots and severe reduction of root and shoot biomass. Recently, it has been shown that P. indica infested plants are more resistant to Fusarium culmorum. In the current study, the interaction of P. indica with Fusarium graminearum in barley roots was analyzed. Upon infestation with P. indica, roots were protected from Fusarium infections as evidenced by reduced root rot symptoms. Consistently, Fusarium quantification using quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) revealed a correlation between reduced root rot symptoms and the relative amount of fungal DNA in the roots. Expression of pathogenesis related (PR) genes, which strongly increased in response to F. graminearum infections, was diminished in the presence of P. indica. This finding indicates that PR proteins do not play a crucial role in the P. indica-mediated resistance response to Fusarium.
While P. indica is emerging as a model fungus to study mutualistic plant-fungus interactions, genetic transformation has not been accomplished yet. Transformation of the fungus by biolistic gene transfer and analysis of transgene expression in its saprophytic phase was performed. The transcriptionally active nature of the constitutive Aspergillus nidulans glyceraldehyde 3-phosphate (gpd) promoter and suitability of red fluorescent protein DsRed as a reporter gene in P. indica was established. The genes for hygromycin (Hyg-B) resistance and DsRed were employed as markers. Patches of fluorescent hyphae and chlamydospores were observed upon fluorescence microscopic examination of hygromycin-resistant mycelia. The procedure described here lays the ground for the use of yet unavailable molecular genetic tools in analyzing a plant root endophytic fungus.
Keywords: biodiversity, mycorrhiza, rhizosphere, Sebacinales, systemic resistance, Fungal transformation, Symbiosis, mutualistic
Kurzfassung auf Deutsch: Pflanzenwurzeln sind potenzielle Wirte einer Vielzahl von Mikroorganismen einschließlich Mykorrhizapilzen, Rhizobien sowie endophytischen Pilzen der kürzlich bestimmten Ordnung Sebacinales (Basidiomycota). Der jüngst entdeckte Wurzelendophyt Piriformospora indica ist ein Modellorganismus dieser Pilzordnung. Der axenisch kultivierbare P. indica kolonisiert Wurzeln einer großen Anzahl ein – und zweikeimblättriger Pflanzenarten, einschließlich Getreidepflanzen und Brassicaceen. Die Symbiose ist durch eine erhöhte Biomasse und Ertragszuwächse in wirtspflanzen charakterisiert. In Gerste induziert der Endophyt lokale und systemische Resistenz gegen pilzliche Krankheiten und Toleranz gegenüber abiotischem Stress. Zur Aufklärung des Lebensstils von P. indica wurden Pilzentwicklung und Wirtsreaktionen in der mutualistischen Symbiose mit Gerstenwurzeln untersucht. Es wurde gezeigt, dass P. indica genau wie andere mutualistische Endophyten, Wurzeln in asymptomatischer Weise durch Erhaltung der Antagonismus Balance kolonisiert. Die pilzliche Kolonisierung steigt mit dem Alter des Wurzelgewebes. Das Gewebe der Wurzelspitze zeigte keine Besiedlung und die Elongationszone wies hauptsächlich interzelluläre Kolonisierung auf. Im Gegensatz dazu war die Differenzierungszone stark mit inter- und intrazellulären Hyphen und intrazellulären Chlamydosporen besiedelt. Die Mehrzahl der Hyphen wuchs interzellulär in toten rhizodermalen und kortikalen Zellen, die zu späteren Interaktionsstadien vollständig mit Chlamydosporen gefüllt waren. In einigen Fällen penetrierten die Hyphen Zellen und bildeten ein Netzwerk um plasmolysierte Protoplasten, was zu der Vermutung führt, dass der Pilz entweder Zellen aktiv tötet oder Zellen wahrnimmt, die gerade endogenen programmierten Zelltod unterlaufen. Allerdings wurde eine reduzierte Expression des Gerstengens BAX inhibitor-1 (HvBI-1), eines negativen Zelltodregulators, während der Wurzelkolonisierung gemessen. Damit übereinstimmend war die Verbreitung des Pilzes stark in transgenen Gerstenpflanzen inhibiert, die GFP-markiertes HvBI-1 überexprimierten. Die zytologischen Beobachtungen und der genetische Hinweis zeigen, dass der Zelltod in differenzierten Gerstenwurzelgewebe der Vermehrung von P. indica dient und dass der Endophyt in das Zelltodprogramm des Wirtes eingreift, um eine mutualistische Interaktion mit Pflanzen zu etablieren.
Infektion von Pflanzenwurzeln mit pathogenen nekrotrophen Pilzen der Gattung Fusarium führt zu nekrotisierten Wurzeln und schwerwiegender Reduktion von Biomasse in Wurzel und Spross. Kürzlich wurde gezeigt, dass mit P. indica infizierte Pflanzen eine höhere Resistenz gegenüber Fusarium culmorum aufweisen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion von P. indica mit Fusarium graminearum in Gerstewurzeln analysiert. Nach Befall mit P. indica waren Wurzeln gegen Infektionen mit Fusarium geschützt, was sich durch reduzierte Symptome der Wurzelfäule zeigte. Damit einhergehend konnte durch Quantifizierung mittels quantitativer Polymerase Kettenreaktion (Q-PCR) eine Korrelation zwischen reduzierten Symptomen der Wurzelfäule und der relativen Menge an Pilz-DNA in Wurzeln hergestellt werden. Die nach F. graminearum Infektion stark erhöhte Expression von Pathogenese bezogenen (PR) Genen war bei Anwesenheit von P. indica reduziert. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass PR-Proteine keine entscheidende Rolle bei der P. indica vermittelten Resistenzantwort auf Fusarium spielen.
P. indica entwickelt sich mehr und mehr zum Pilzmodell für das Studium einer mutualistischen Pflanze-Pilz Interaktion, genetische Transformation konnte bisher jedoch noch nicht erreicht werden. Transformation des Pilzes mittels biolistischem Gentransfer und Analyse der Expression des Transgens in seiner saprophytischen Phase wurde im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt. Der transkriptionell konstitutiv aktive Aspergillus nidulans glyceraldehyde 3-phosphate (gdp) Promotor und die Eignung von rot fluoreszierendem Protein DsRed als Reportergen wurde in P. indica etabliert. Die Gene für Hygromycin (Hyg-B) Resistenz und DsRed wurden als Marker verwendet. Bei Untersuchung von Hygromycin resistenten Mycelien im Fluoreszensmikroskop wurden Bereiche von fluoreszierenden Hyphen und Chlamydosporen beobachtet. Die hier beschriebene Prozedur legt die Basis für bisher nicht verfügbare molekulare genetische Werkzeuge zur Untersuchung endophytischer Pilze in Pflanzenwurzeln.