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Pharmakologische Modulation der durch alpha-Hämolysin von Escherichia coli an humanen embryonalen Nierenzellen gebildeten Poren

Ünver, Baris


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Rudolf-Buchheim-Institut für Pharmakologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.05.2007
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 14.06.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Alpha-Hämolysin (alphaHly) ist ein essentieller Pathogenitätsfaktor des gramnegativen Bakteriums Escherichia coli. AlphaHly wird meist von uropathogenen E. coli Stämmen produziert und kann neben einer direkten Zelllyse auch eine Reihe von sekundären Zellreaktionen auslösen.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Porenbildung durch alphaHly elektro- physiologisch an humanen embryonalen Nierenzellen charakterisiert. Für die halbmaximale Porenbildung durch alphaHly wurde ein EC50-Wert von 47 ng/ml ermittelt, was der sehr niedrigen Konzentration von 427 pM entspricht. Der Hill-Koeffizient aus der Konzentrations-Wirkungsbeziehung betrug 1,8, was dafür spricht, dass mindestens zwei alphaHly-Moleküle an der Bildung einer funktionellen Pore beteiligt sind. Es zeigte sich, dass die alphaHly-Poren ausschließlich schnelle Öffnungen und Schlüsse aufweisen, womit sich ihre Porenkinetik von anderen in unserer Arbeitsgruppe bereits charakterisierten Toxinen, wie Listeriolysin und Pneumolysin, deutlich unterscheidet. Die Amplitudenverteilung der alphaHly-Porenströme ergab ein einzelnes Maximum mit einem Wert von 18,5 pA bei einem Membranpotential von -40 mV, womit sich für die einzelne alphaHly-Pore eine Porenleitfähigkeit von 463 pS errechnet.

Mit Hilfe der Punktmutanten deltaB und deltaAB konnte eine für die Porenbildung essentielle Aminosäure an Position 690 des alphaHly-Moleküls identifiziert werden. Es bleibt aber noch unklar, ob die Aminosäure Lysin selbst oder ihre Fettsäuren-Acylierung, im Sinne einer posttranslationalen Modifikation, essentiell für die Porenbildung ist. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass ein Mix aus Toxinmutante deltaB bzw. deltaAB und Wildtyp-Toxin im Vergleich zum Wildtyp-Toxin alleine zu einer signifikant verminderten Porenbildung führte. Dies spricht ebenso, wie der ermittelte Hill-Koeffizient, für eine Beteiligung von mehreren alphaHly-Molekülen an der Bildung einer funktionellen Pore.

Es konnte nachgewiesen werden, dass die Porenbildung durch alphaHly reversibel ist. Die Hemmung der zytoskelettalen Komponenten Aktin und Tubulin führt zu einer signifikant erhöhten Zahl offener Poren/min. Dies könnte dafür sprechen, dass am Verschluss offener alphaHly-Poren aktin- bzw. tubulin-abhängige endozytotische Prozesse beteiligt sind. Auf eine Beteiligung von Tyrosinkinasen und MAP-Kinasen an der Porenbildung durch alphaHly ergaben sich in den durchgeführten Experimenten hingegen keine Hinweise.

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Substanzen auf eine mögliche Blockade offener alphaHly-Poren untersucht. Dabei zeigte sich, dass der Farbstoff Eosin Y, der offene Listeriolysin-Poren blockiert, keinen Einfluss auf alphaHly-Poren hat. Auch die Farbstoffe Brilliantgrün, Fuchsin, Säurefuchsin, Gentianaviolett und Methylenblau, sowie die Calciumkanalblocker Nifedipin und Nicardipin, hatten keinen Einfluss auf die alphaHly-Poren. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Lanthanoide Gadolinium, Lanthan und Ytterbium alphaHly-Poren blockieren können, wobei die EC50-Werte für die halbmaximale Blockade des Porenstroms, im niedrigen mikromolaren Bereich lagen und Gadolinium die höchste Potenz zeigte. Patienten mit uropathogenen E.coli-Infektionen könnten in Zukunft von diesen Porenblockern profitieren. Auf der Basis unserer Daten müssen sich nun weitere Versuche, wie die Untersuchung von Lanthanoiden im Sepsis-Modell der Maus, anschließen.
Kurzfassung auf Englisch: Alpha-Haemolysin (alphaHly) is an essential virulence factor of the Gram-negative bacterium Escherichia coli. alphaHly is commonly produced by uropathogenic E. coli strains and can lead directly to cell lysis but also to several secondary cell responses. The present work chracterizes electrophysiologically the pore formation by alphaHly in human embryonic kidney cells. For halfmaximal pore formation by alphaHly we found an EC50-value of 47 ng/ml, which corresponds to a very low concentration of 427 pM. The Hill coefficient of the concentration-response relationship was 1.8, indicating that at least two alphaHly molecules are necessary for the formation of a functional pore. AlphaHly pores exhibited only fast openings and closures, making this pore kinetics very different from the one of other toxins recently characterized in our group, such as listeriolysin and pneumolysin. The amplitude histogram of the alphaHly pore currents showed a single maximum of 18,5 pA at a membrane potential of -40 mV, corresponding to a single pore conductance of 463 pS.

Using the mutants deltaB and deltaAB, a single residue that is essential for the pore forming ability of the alphaHly molecule was identified at position 690. It is unclear yet whether the amino acid lysine itself or its fatty acid acylation, as a posttranslational modification, is essential for the pore formation. Furthermore, we showed that a mix of the mutants deltaB or deltaAB together with the wild-type toxin led to a significantly reduced pore formation compared to wild-type alone. This result, as well as the measured Hill coefficient, rules out the idea that a single alphaHly molecule may be sufficient to form a functional pore.

The pore formation by alphaHly is reversible. The inhibition of the cytoskeletal components actin und tubulin led to a significant increase in the number of open pores/min. This might indicate that actin- or tubulin-dependent endocytotic mechanisms are involved in the closure of open alphaHly pores. In contrast, we did not find any indication for a possible involvement of tyrosine kinases or MAP kinases in the pore formation by alphaHly.

Various substances were tested for their possible ability to block open alphaHly pores. Eosin Y, a dye that blocks listeriolysin pores, had no influence on alphaHly pores. This negative result was also observed for the dyes brilliant green, fuchsin, acid fuchsin, gentian violet and methylene blue, as well as for the calcium channel blockers nifedipine and nicardipine. In contrast, the lanthanoids gadolinium, lanthanum and ytterbium blocked alphaHly pores with EC50-values for halfmaximal blockade of the pore current in the low micromolar range, whereby gadolinium showed the highest potency. Patients who are infected by uropathogenic E. coli might benefit from these pore blockers in the future. On the basis of our results further experiments investigating the effects of lanthanoids, e.g. in the mouse sepsis model, are now necessary.