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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-46851
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2007/4685/


Nachweis und Reaktivität epithelialer und mesenchymaler Zielzellen für Escherichia coli Shigatoxin in den Kolonkrypten des Rindes

Mohr, Melanie


Originalveröffentlichung: (2007) Giessen : VVB Laufersweiler 2007
pdf-Format: Dokument 1.pdf (13.117 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5150-1
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.04.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 29.05.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Die Shigatoxin- (Stx-)induzierte Sekretion pro-inflammatorischer Chemokine durch Epithelzellen ist ein zentrales Ereignis in der Pathogenese intestinaler Entzündungen, die beim Menschen durch Stx-bildende E. coli (STEC) hervorgerufen werden können. Das Vorkommen von Stx-Rezeptoren auf Zellen in Kolonkrypten des Rindes warf die Frage nach der Bedeutung dieser Zellen in der Pathogenese der STEC-Infektion des Rindes auf. In einem erstmals für infektions-immunologische Fragestellungen verwendeten in vitro-Modell boviner Kolonzellen wurde deshalb die Wirkung von Stx1 auf verschiedene Zellfunktionen mittels Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie und reverser „Real time“ PCR untersucht.

In den aus der Darmschleimhaut von Schlachtrindern gewonnenen Kulturen primärer Kolonzellen lag der Anteil an Epithelzellen zwischen 80 und 95 %. Die Epithelzellen bildeten partiell „tight junctions“ aus. Eine im Vergleich zu CaCo-2-Zellen jedoch nur geringe Expression von Leitenzymen ließ auf eine bereits nach wenigen Tagen eintretende Entdifferenzierung der Zellen schließen. Trotzdem behielten sie die Fähigkeit zur Transkription und Sekretion ausgewählter Chemokine bei, wie durch reverse „Real time“ PCR und Granulozyten-Migrationsstudien nachgewiesen werden konnte.

Durchflusszytometrische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass 15 bis 20 % der kultivierten Epithelzellen über den Stx-Rezeptor CD77 verfügten. Die Expression von CD77 war bei Epithelzellen nicht nur an der Oberfläche, sondern vor allem intrazellulär in Kernnähe nachweisbar. Stx1 veränderte weder die zelluläre Verteilung des CD77 noch die epitheliale Apoptoserate. Die Untersuchung primärer Epithelzellkulturen mit reverser „Real time“ PCR ergab, dass unter der Wirkung von Stx1 eine geringgradige Zunahme von mcp-1-Transkripten auftrat. Keinen Einfluss dagegen übte Stx1 auf den Gehalt an mRNA für TGF-beta sowie für Gro-alpha, RANTES und IL-8 aus. Migrationsstudien mit bovinen Granulozyten bestätigten, dass Stx1 auch die Sekretion granulozytotroper Chemokine aus Epithelzellen nicht veränderte.

Neben den Epithelzellen kamen in geringer Anzahl auch mesenchymale Zellen in den Primärkulturen vor. Ein Teil dieser Zellen wies eine starke, oberflächlich lokalisierte Stx-Rezeptor-Expression auf und reagierte auf Stx1 mit einer Rezeptor-Umverteilung von der Zelloberfäche in intrazelluläre Kompartimente. Darüberhinaus hatte die Inkubation mit Stx1 zwar nur einen geringradigen Einfluss auf die Stoffwechselaktivität mesenchymaler Kolonzellkulturen, führte aber zur Eliminierung der CD77-exprimierenden Zellpopulation.

Zur besseren funktionellen Charakterisierung der Stx-sensiblen Mesenchymalzellen wurden sie mit dem Plasmid pSVneo3 transfiziert und immortalisiert. Es entstanden mehrere Zellklone, von denen einer aufgrund seiner starken CD77-Expression zur weiteren Charakterisierung ausgewählt wurde. Die Zellen dieses Kolonzell-Klons exprimierten neben MHC I auch den Monozyten/Makrophagen-Marker CD14 sowie das auf myeloiden und dendritischen Zellen vorkommende CD172a. Unter Einwirkung von Stx1 kam es zu einer Umverteilung des Rezeptors von der Zelloberfläche in intrazelluläre Kompartimente. Auf LPS-Stimulation reagierten die Zellen mit einer erhöhten il-12-Transkription. Bei gleichzeitiger Anwesenheit von LPS und Stx1 synthetisierten sie jedoch vermehrt il-10-mRNA. Außerdem induzierte Stx1 die Transkription der Chemokingene il-8, gro-alpha, mcp-1 und rantes, die sich bei gleichzeitiger Einwirkung von LPS bis zum 70-fachen steigern ließ.
Die Ergebnisse zeigen, dass Stx1 für bovine Kolonepithelzellen nicht zytotoxisch ist. Bovine intestinale Epithelzellen sind auch im Hinblick auf die Sekretion ausgewählter Chemokine gegenüber Stx1 resistent. Im Bereich der Kolonkrypten des Rindes konnten jedoch erstmals mesenchymale Zellen als Zielzellen für Stx1 identifiziert werden. Durch ihre Fähigkeit, verschiedene Botenstoffe des Immunsystems zu exprimieren, könnten diese Zellen bei der STEC-Infektion des Rindes eine große Bedeutung besitzen.
Kurzfassung auf Englisch: Shiga toxin (Stx) induced secretion of pro-inflammatory chemokines by epithelial cells represents a central event in the pathogenesis of intestinal inflammation that can be provoked in humans by Stx-producing E. coli (STEC). The presence of Stx-receptors on bovine colonic crypt cells raised the question as to the role of epithelial cells during STEC-infections in cattle. Therefore, the effect of Stx1 on several cell functions was examined by flow cytometry, fluorescence microscopy and reverse Real-time PCR. Experiments were performed using an in vitro-model of bovine colonic cells firstly introduced for immunobiological studies.

In primary cultures of colonic cells isolated from gut specimens of slaughtered cattle, 80-95 % of the cells were of epithelial origin. The epithelial cells partially formed tight junctions. However, minimal expression of distinct marker enzymes as compared to CaCo-2 cells suggested, that the primary cell cultures started to dedifferentiate after a few days in culture. Nevertheless, the cells retained their abilities to transcribe and secrete certain chemokines proven by reverse Real-time PCR and granulocyte migration assays. Flow cytometry and fluorescence microscopy analyses revealed that 15-20 % of the epithelial cells possessed the Stx-receptor CD77. CD77 could be detected on the surface of epithelial cells, but was mainly located in the cytoplasma surrounding the nuclei. Stx1 neither had influence on the CD77 expression patterns nor the onset of apoptosis in epithelial cells. Examination of the primary cells cytokine/chemokine profile by reverse Real-time PCR revealed a slight increase of mcp-1-transcripts in the presence of Stx1. Stx1 had no influence on the content of mRNA specific for TGF-beta, Gro-alpha, RANTES and IL-8. Migration studies with bovine granulocytes confirmed that stimulation with Stx1 did not alter the release of granulocytotropic chemokines from epithelial cells.

Beside epithelial cells, primary colonic crypt cell cultures regularly contained low numbers of mesenchymal cells. These were characterized by a strong surface expression of CD77. In the presence of Stx1, the cells redistributed CD77 from the cell surface into intracellular compartments. Furthermore, incubation with Stx1 had a minor influence on the metabolic activity of mesenchymal cells but eliminated CD77-expressing cells from the cultures.
In order to better characterize these Stx-sensible, mesenchymal cells on a functional level, the cells were immortalized by transfection with the plasmid pSVneo3. From the resulting cell clones one was chosen for further characterization due to its strong expression of CD77. In addition to MHC I, the cloned cells expressed the monocyte/macrophage marker CD14 and the CD172a antigen, present on myeloid and dendritic cells. Stx1 affected the redistribution of CD77 from the cell surface into intracellular compartments. LPS-stimulation led to an increased il-12-transcription in these cells. However, when LPS and Stx1 were added to the cultures simultaneously, the cells produced elevated amounts of il-10-mRNA. Stx1 also induced the transcription of the chemokine genes il-8, gro-alpha, mcp-1 and rantes, that were enhanced by up to 70-fold when LPS was also present.

The results demonstrate that Stx is not cytotoxic for bovine colonic epithelial cells. Furthermore, bovine intestinal epithelial cells are resistant to Stx1 with respect to the secretion of selected chemokines. This is the first study identifying mesenchymal cells as target cells for Stx1 in the bovine gut. Refering to their capability to express distinct mediators of the immune system, these cells may be of great relevance for the course of STEC-infections in cattle.