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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-46417
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2007/4641/


Untersuchungen zur Suppression der NF-kappaB-Aktivierung in Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli (STEC) infizierten Säugerzellen

Investigating the suppression of NF-kappaB activation in mammalian cells infected with Shiga Toxin-producing Escherichia coli (STEC)

Krabs, Isabel


Originalveröffentlichung: (2007) Giessen : <a href=http://www.dvg.net/>DVG Service</a> 2007
pdf-Format: Dokument 1.pdf (8.718 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): STEC , NF-kappaB , Immunsuppression , angeborene Immunität , Infektionsmechanismus
Freie Schlagwörter (Englisch): STEC , NF-kappaB , immunsuppression , innate immunity , infection mechanism
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Medizinische Mikrobiologie
Fachgebiet 1: Veterinärmedizin
Fachgebiet 2: Biologie
Fachgebiet 3: Medizin fachübergreifend
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
ISBN / ISSN: 978-3-939902-30-0
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.04.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 10.05.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegende Arbeit dient der Aufklärung des molekularen Infektionsmechanismus von STEC sowie der Untersuchung der pathobiologischen Bedeutung der STEC-Infektion für die angeborene Immunität. Die Untersuchungen basieren auf der von STEC hervorgerufenen Suppression des Transkriptionsfaktors NF-kappaB in Epithelzellen, der die Transkription proinflammatorischer Zytokine initiiert und damit eine Proinflammation auslöst.

So zeigte sich, dass diese NF-kappaB-Suppression nach STEC-Infektion auch in Zellen, die der angeborenen Immunität angehören – Zellen der etablierten murinen makrophagen-ähnlichen Zelllinie P388D1 und ausdifferenzierte primäre Knochenmarksmakrophagen –, entsteht. Auffällig war dabei, dass die initiale NF-kappaB-Aktivierung und die anschließende Suppression in den Immunzellen wesentlich schneller und effizienter erfolgte als in den Epithelzellen. Somit ist die Inhibierung der Proinflammation kein Epithelzell-spezifisches Ereignis. Sie scheint vielmehr ein genereller Mechanismus für den Erreger zu sein. Auch die initiale NF-kappaB-Aktivierung scheint nicht nur eine Reaktion der Wirtszellen auf "Pathogen-associated molecular patterns" (PAMPs), sondern vielmehr ein nötiger Mechanismus des Bakteriums zu sein, um letztendlich eine vollständige NF-kappaB-Suppression herbeiführen zu können. Diese ist irreversibel, so dass auch nachfolgend, für mindestens 25 Stunden, keine Stimulation der Zellen mit bekannten NF-kappaB-aktivierenden Substanzen (LPS, TNF-alpha) mehr möglich ist.
Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse kann mit Sicherheit gesagt werden, dass der bakterielle Faktor, welcher die Inhibierung der NF-kappaB-aktivierenden Signaltransduktionswege bewirkt, nicht in den bakteriellen Kulturüberstand abgegeben, sondern direkt aus dem bakteriellen Zytoplasma in das Zytoplasma der Wirtszelle transloziert wird. Folglich können nur lebende STEC-Bakterien die Suppression von NF-kappaB herbeiführen.
Die am besten untersuchte Pathogenitätsinsel (PAI) von STEC (sowie EPEC und EHEC) ist der "Locus of enterocyte effacement" (LEE). Auf ihm ist das komplette Typ-III-Sekretions-System (TTSS), durch welches Effektoren aus der Bakterienzelle in die Wirtszelle transloziert werden können, lokalisiert. Ursprünglich nahm man an, dass der Effektor, der für die NF-kappaB-Suppression verantwortlich ist, auch auf dieser PAI liegt. Mit Hilfe von apathogenen E. coli, die den klonierten LEE von EPEC E2348/69 in sich tragen, konnte gezeigt werden, dass dies nicht der Fall ist. Das entscheidende Molekül muss demnach entweder von einer anderen PAI oder dem übrigen Genom kodiert werden. Dennoch wird der LEE benötigt, damit das TTSS aufgebaut und der Effektor transloziert werden kann.
Von viel größerem Interesse war jedoch die Stufe der zur NF-kappaB-Aktivierung führenden Signaltransduktionswege, die vom Bakterium moduliert wird. Durch die systematische retrograde Untersuchung konnte gezeigt werden, dass das kappaB-Motiv durch die STEC-Infektion nicht beeinträchtigt wird. Das in der Literatur beschriebene CRM1/Exportin1-abhängige nukleo-zytoplasmatische "Shuttling" von NF-kappaB konnte weder für unbehandelte, nicht infizierte noch für STEC infizierte HeLa-Zellen beobachtet werden. Demnach scheint der Rücktransport von NF-kappaB aus dem Kern in das Zytoplasma CRM1/Exportin1-unabhängig zu verlaufen. Die eingehende Untersuchung der IkappaB-alpha-Phosphorylierung zeigte eindeutig, dass IkappaB-alpha im Verlauf der STEC-Infektion nicht mehr phosphoryliert wird. Daher muss die Stufe, auf der die Inhibierung von NF-kappaB-aktivierenden Signaltransduktionswegen durch STEC stattfindet, oberhalb von IkappaB-alpha liegen, was zukünftig noch zu eruieren ist.
Mit den durchgeführten Mausinfektionsversuchen konnte gezeigt werden, dass die Infektion mit dem STEC 413/89-1 Wildtyp, im Gegensatz zur Infektion mit STEC 413/89-1 espB-Deletionsmutante, starke Beeinträchtigungen des Allgemeinbefindens der infizierten Mäuse bewirkt. Die parallel dazu festgestellte Inhibierung der T-Zell-Proliferationsfähigkeit scheint somit die Hypothese zu stützen, dass die Signalweitergabe der Makrophagen auf die T-Zellen durch die Infektion mit STEC WT beeinträchtigt ist.
Kurzfassung auf Englisch: The present study examines molecular mechanism of STEC infection and investigates the pathobiological meaning of the STEC infection for innate immunity. The analyses are based on the STEC-dependent suppression of the transcription factor NF-kappaB in epithelial cells. NF-kappaB initiates the transcription of proinflammatory cytokines and thereby triggers the proinflammation.
It was shown that NF-kappaB suppression after infection with STEC is also a property seen in primarily involved in innate immunity i.e. either cells of the established murine macrophage-like cellline P388D1 or bone marrow derived macrophages. It was conspicuous that initial NF-kappaB activation and subsequent suppression were faster and more efficient in the immune cells than in the epithelial cells. Thus the inhibition of the proinflammation is not an epithelial cell specific event. It seems rather to be a general mechanism for the pathogen. Also the initial NF-kappaB activation seems not to be only a reaction of the host cell against pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) but also a necessary mechanism of the bacterium to finally lead to complete NF-kappaB suppression. This suppression is irreversible and no stimulation of the cells with well known NF-kappaB activators (LPS, TNF-alpha) is possible for at least 25 hours.
From studies reported here it is now clear that the bacterial factor which causes the inhibition of the NF-kapppaB activating signal transduction pathway is not secreted into the bacterial culture supernatant but translocated directly from the bacterial cytoplasm into the cytoplasm of the host. Thus, only live STEC-bacteria are able to induce the NF-kappaB suppression.

The best analyzed PAI of STEC (both in EPEC and EHEC) is the "Locus of enterocyte effacement" (LEE). It encodes the complete Type-III-secretion-system (TTSS), which is used for translocating effectors out of the bacterium into the host cell. Originally the effector responsible for the NF-kappaB suppression was thought to be located on this PAI. With the help of an apathogenic E. coli containing the cloned LEE from EPEC E2348/69, it was shown that this is not true. The crucial molecule must either be encoded by a gene on another PAI or present in the rest of the genome. The LEE is however needed for constructing the TTSS and translocating the effector.
Of much more interest was the step of the signal transduction pathways leading to NF-kappaB activation and modulated by the bacterium. I showed by systematic retrograde investigations of the NF-kappaB pathway that the kappaB motive was not impaired by the STEC infection. In the literature a CRM1/Exportin1-dependend nucleo-cytoplasmic shuttling of NF-kappaB has been described. I did not observe such an effect with either untreated, non-infected nor with STEC infected HeLa cells. Therefore, the transport of NF-kappaB out of the nucleus into the cytoplasm seems to be independent of CRM1/Exportin1. The detailed investigations of the IkappaB-alpha phosphorylation demonstrate unequivocally that IkappaB-alpha is not phosphorylated during the STEC infection. Thus the step of the NF-kappaB activating signal transduction pathway by STEC must be upstream of IkappaB-alpha. However, future studies are required for further details.
I showed with mouse infection experiments that infection with STEC 413/89-1 wild type in contrast to infection with the STEC 413/89-1 espB deletion mutant results in a strong reduction of the general state of health of the infected mice. The observation that inhibition of the T-cell-proliferation capability occurs, seems to support the hypothesis that the signal transduction from the macrophages to the T-cells is affected by the infection with STEC wild type.