Der mehr oder weniger gleich bleibende Expressionsverlauf der Cox1 wird dahingehend interpretiert, dass Cox1 die klassische Funktion eines Housekeeping-Genes ausübt; die erniedrigte Expression des Enzyms am Tag 5 p.o. wird auf die sehr hohe Expression der Cox2 zum selben Zeitpunkt zurückgeführt und mit einem Shift in der Bereitstellung von Enzymen zugunsten Cox2 erklärt. Die Expression von Cox2 sank nach einem Höchstwert am Tag 5 p.o. deutlich ab (p < 0,05), am Tag 15 p.o. wurde nur noch weniger als die Hälfte der Ausgangskonzentration gemessen; ab Tag 25 p.o. blieben die Werte in unteren Messbereich. Immunhistochemie und in situ one-step RT-PCT haben die Expression der Cox2 in dem Zytoplasma der Luteinzellen an den Tagen 5 und 15 p.o. lokalisiert.
Auch die Expression der PGES war zu Beginn des Diöstrus am stärksten (Tag 15 p.o.) und zeigte einen signifikanten Abfall bis zu den Tagen 45 und 65 p.o.. Eine Expression der PGFS konnte dagegen zu keinem Zeitpunkt nachgewiesen werden. Der zeitliche Verlauf der Expression von Cox2 und PGES lässt die Folgerung zu, dass den lokal im CL produzierten Prostaglandinen (E-Reihe) eine luteotrope Wirkung bei der Anbildung der CL zukommen könnte. Die fehlende Expression von PGFS zeigt, dass das canine CL nicht in der Lage ist, PGF2alpha direkt aus PGH2 via PGFS zu produzieren.
Die Expression des PGFR stieg bis Tag 25 p.o. an, und blieb danach mehr oder weniger konstant. Dies wird als eine konstitutive Expression des PGFR im caninen CL im Verlauf des Diöstrus interpretiert, was die dosisabhängige Empfänglichkeit des CL gegenüber exogen verabreichtem PGF2alpha erklären würde. Die ausschliessliche Lokalisation der Expression der PGFR-mRNA in den Luteinzellen zeigt, dass diese das einzige Target für PGF2alpha im CL darstellen.
Die Expression der 3betaHSD im CL war erwartungsgemäss positiv mit der Progesteron-Konzentration im peripheren Blut korreliert. Sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene waren die stärksten Signale am Anfang der CL-Phase vorhanden. Der sich anschließende Abfall der Expression bis zum Ende der Beobachtungsperiode entsprach der sinkenden Progesteronproduktion am Ende des Diöstrus. Die IHC und ISH haben die Expression der 3betaHSD auschließlich im Zytoplasma der Luteinzellen lokalisiert. "> Expression of Cox1 during dioestrus was rather constant, indicating the classical function of a housekeeping-gene. The somewhat depressed expression on day 5 p.o. was interpreted as result of the rather high expression of Cox2 at the same point of time due a shift in the provision of enzymes in favour of Cox2. Expression of Cox2 was highest on day 5 p.o., it dropped significantly (p < 0,05) by about 50 % until day 15 p.o., after day 25 p.o. expression was at the lower detection limit. IHC and in situ one-step RT-PCR localized expression of Cox2 in the cytoplasm of luteal cells on days 5 and 15 p.o.. Also expression of PGES was highest at the beginning of dioestrus (day 15 p.o.) and showed a significant drop towards days 45 and 65 p.o.. At no times expression of PGFS could be detected by routine qualitative RT-PCR. The time-course in the expression of Cox2 and PGES allows the conclusion, that the locally produced prostaglandins (E-type) act luteotrophic during the period of formation of the corpora lutea. The lack in the expression of PGFS suggest that the canine CL is unable to convert PGE2 directly into PGF2alpha. However, possible alternative synthetic pathways with PGE2 and/or PGD2 as a substrate were not determined.
Expression of PGFR increased until day 25 p.o., thereafter it remained fairly constant. This is interpreted as a constitutive expression of the PGFR in the canine CL during the course of the dioestrus, which would explain the dose-dependend responsiveness of the canine CL towards exogenously applied PGF2alpha. PGFR-mRNA was exclusively located in luteal cells, indicating that these cells are the only target for PGFalpha in the CL.
As was to be expected expression of the 3beta HSD in the CL was positively correlated with peripheral progesterone blood plasma concentrations. Strongest signals on the protein- and the mRNA-level were obtained at the beginning of the CL-phase. This was followed by decrease in the expression until the end of the observation period, matching the decrease of the progesterone concentrations. IHC and ISH exclusively located expression of 3beta HSD in the cytoplasm of the luteal cells.">
 

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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-44769
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Untersuchungen zur Rolle des Prostaglandin Systems in der Regulation der Corpus Luteum Funktion der Hündin durch Erfassung der Expression von Cyclooxygenase 1 und -2 (Cox1,-2), Prostaglandin F2alpha Synthase (PGFS), Prostaglandin E2 Synthase (PGES) und Prostaglandin F2alpha Rezeptor (PGFR)

Kowalewski, Mariusz Pawel


Originalveröffentlichung: (2007) Lollar : Rosenbaum 2007 (Reproduction in Domestic Animals 39 (2004) S. 232-240; Theriogenology 66 (2006) S. 1432-1430; Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 101 (2006) S. 254-262 )
pdf-Format: Dokument 1.pdf (4.259 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Corpus luteum - Funktion , Hündin , Prostaglandine
Freie Schlagwörter (Englisch): Corpus luteum function , bitch , prostaglandins
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
ISBN / ISSN: 987-3-9811536-0-6
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.01.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 15.02.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Anders als bei landwirtschaftlichen Nutztieren wird beim nicht graviden Hund die Rückbildung der CL nicht durch ein Luteolysin uterinen Ursprungs (PGF2alpha) verursacht. Bei der graviden Hündin dagegen weist der parallel zur präpartalen Luteolyse auftretende PGF2alpha-Anstieg möglicherweise auf einen funktionalen Zusammenhang hin.

In vorliegenden Untersuchungen wurde daher der Frage nachgegangen, ob bei der nicht graviden Hündin im CL produzierte Prostaglandine (PG) als parakrine und/oder autokrine Regelfaktoren eine Rolle bei der Rückbildung der CL spielen können. Dazu wurden auf CL Ebene die Expression der Cyclooxygenase 1 und -2 (Cox1, Cox2) der Prostaglandin F2alpha- und Prostaglandin E2- Synthase (PGFS und PGES) und des Prostaglandin F2alpha- Rezeptor (PGFR) an den Tagen 5, 15, 25, 35, 45 und 65 post ovulationem charakterisiert.

Den Untersuchungen zur Erfassung der 3beta Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3betaHSD) lag die Überlegung zugrunde, dass die Expression dieses Schlüsselenzyms der Steroidbiosynthese sowohl als Parameter zur Charakterisierung des Funktionszustandes der Luteinzellen herangezogen werden kann, als auch einen Endpunkt einer die Progesteronsekretion kontrollierenden Reaktionskaskade darstellen könnte.

Die Untersuchungen zur Expression von Cox 1 und -2 erfolgten auf mRNA-Ebene mittels qualitativer und quantitativer RT-PCR. Die Lokalisation der Cox2 erfolgte auf mRNA Ebene mittels in situ one-step RT-PCR und auf Proteinebene mittels Immunhistochemie (IHC).

Da die hundespezifischen Sequenzen von PGFS, PGES, PGFR und 3betaHSD bislang nicht bekannt waren, wurden diese zunächst kloniert und sequenziert (SMART RACE PCR und "homology cloning"). Die ermittelten Sequenzen wurden in die Genbank eingetragen (Eintragsnummern: AY875970 für PGFS, EF063141 für PGES, DQ138060 für PGFR, AY739720 für 3betaHSD). Die weiteren Untersuchungen erfolgten mittels qualitativer und quantitativen RT-PCR.
Die Lokalisation der Expression der 3betaHSD und des PGFR erfolgte auf mRNA- Ebene mittels in situ Hybridisierung (ISH), die 3betaHSD wurde auch noch auf Proteinebene mittels IHC erfasst.

Der mehr oder weniger gleich bleibende Expressionsverlauf der Cox1 wird dahingehend interpretiert, dass Cox1 die klassische Funktion eines Housekeeping-Genes ausübt; die erniedrigte Expression des Enzyms am Tag 5 p.o. wird auf die sehr hohe Expression der Cox2 zum selben Zeitpunkt zurückgeführt und mit einem Shift in der Bereitstellung von Enzymen zugunsten Cox2 erklärt. Die Expression von Cox2 sank nach einem Höchstwert am Tag 5 p.o. deutlich ab (p < 0,05), am Tag 15 p.o. wurde nur noch weniger als die Hälfte der Ausgangskonzentration gemessen; ab Tag 25 p.o. blieben die Werte in unteren Messbereich. Immunhistochemie und in situ one-step RT-PCT haben die Expression der Cox2 in dem Zytoplasma der Luteinzellen an den Tagen 5 und 15 p.o. lokalisiert.

Auch die Expression der PGES war zu Beginn des Diöstrus am stärksten (Tag 15 p.o.) und zeigte einen signifikanten Abfall bis zu den Tagen 45 und 65 p.o.. Eine Expression der PGFS konnte dagegen zu keinem Zeitpunkt nachgewiesen werden.
Der zeitliche Verlauf der Expression von Cox2 und PGES lässt die Folgerung zu, dass den lokal im CL produzierten Prostaglandinen (E-Reihe) eine luteotrope Wirkung bei der Anbildung der CL zukommen könnte. Die fehlende Expression von PGFS zeigt, dass das canine CL nicht in der Lage ist, PGF2alpha direkt aus PGH2 via PGFS zu produzieren.

Die Expression des PGFR stieg bis Tag 25 p.o. an, und blieb danach mehr oder weniger konstant. Dies wird als eine konstitutive Expression des PGFR im caninen CL im Verlauf des Diöstrus interpretiert, was die dosisabhängige Empfänglichkeit des CL gegenüber exogen verabreichtem PGF2alpha erklären würde. Die ausschliessliche Lokalisation der Expression der PGFR-mRNA in den Luteinzellen zeigt, dass diese das einzige Target für PGF2alpha im CL darstellen.

Die Expression der 3betaHSD im CL war erwartungsgemäss positiv mit der Progesteron-Konzentration im peripheren Blut korreliert. Sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene waren die stärksten Signale am Anfang der CL-Phase vorhanden. Der sich anschließende Abfall der Expression bis zum Ende der Beobachtungsperiode entsprach der sinkenden Progesteronproduktion am Ende des Diöstrus. Die IHC und ISH haben die Expression der 3betaHSD auschließlich im Zytoplasma der Luteinzellen lokalisiert.
Kurzfassung auf Englisch: Other than in food animals an endocrine luteolysin (PGF2alpha) of uterine origin is not responsible for luteal regression in the non pregnant bitch. However, in pregnant bitches prepartal luteolysis coincides with an increase of PGF2alpha indicating a likely functional interrelationship; this conforms with observations that luteolysis and hence abortion can be induced in bitches by PGF2alpha given in the respective dosages.

The present paper therefore addresses the question whether in the dog prostaglandins (PG) synthesized in the corpora lutea (CL) may act as paracrine and/or autocrine factors involved in the mechanisms leading to regression of the cyclic CL. Consequently expression of the key enzymes of prostaglandin synthesis, Cyclooxygenase 1 and 2 (Cox1, Cox2) as well as of prostaglandin F2alpha- and prostaglandin E2- synthase (PGFS and PGES) and the prostaglandin F2alpha- receptor (PGFR) were assed at defined stages of luteal function (days 5, 15, 25, 35, 45 and 65 after ovulation, p.o.).
In addition expression of 3beta-hydroxysteroid-dehydrogenase (3betaHSD) was determined based on the assumption, that this key enzyme of steroid biosythesis may serve as a parameter to characterize the functional stages of luteal cells and that its expression might represent an end-point of a reaction-cascade controlling progesterone production.

On the mRNA-level expression of Cox1 and -2 was assessed by qualitative and quantitative RT-PCR. Localization of Cox2 on the mRNA-level was by in situ one-step RT-PCR and on the protein-level by immunohistochemistry (IHC) using a monoclonal antibody from the mouse directed against Cox2 of the rat (IgG1, clone 33, BD Pharmingen).

As the canine specific sequences of PGFS, PGES, PGFR and 3betaHSD were not known, cloning and sequencing had to be performed. This was achieved via SMART RACE PCR and "homology cloning". The derived sequences were submitted to the Genbank and the following numbers were given: AY875970 for PGFS, EF063141 for PGES, DQ138060 for PGFR and AY739720 for 3betaHSD.
In situ hybridization (ISH) served to localize expression of 3betaHSD and PGFR on the mRNA-level. On the protein-level expression of the 3βHSD was assessed via IHC using a polyclonal antiserum from rabbit directed against human type I (placenta) 3beta HSD.

Expression of Cox1 during dioestrus was rather constant, indicating the classical function of a housekeeping-gene. The somewhat depressed expression on day 5 p.o. was interpreted as result of the rather high expression of Cox2 at the same point of time due a shift in the provision of enzymes in favour of Cox2. Expression of Cox2 was highest on day 5 p.o., it dropped significantly (p < 0,05) by about 50 % until day 15 p.o., after day 25 p.o. expression was at the lower detection limit. IHC and in situ one-step RT-PCR localized expression of Cox2 in the cytoplasm of luteal cells on days 5 and 15 p.o..
Also expression of PGES was highest at the beginning of dioestrus (day 15 p.o.) and showed a significant drop towards days 45 and 65 p.o.. At no times expression of PGFS could be detected by routine qualitative RT-PCR. The time-course in the expression of Cox2 and PGES allows the conclusion, that the locally produced prostaglandins (E-type) act luteotrophic during the period of formation of the corpora lutea. The lack in the expression of PGFS suggest that the canine CL is unable to convert PGE2 directly into PGF2alpha. However, possible alternative synthetic pathways with PGE2 and/or PGD2 as a substrate were not determined.

Expression of PGFR increased until day 25 p.o., thereafter it remained fairly constant. This is interpreted as a constitutive expression of the PGFR in the canine CL during the course of the dioestrus, which would explain the dose-dependend responsiveness of the canine CL towards exogenously applied PGF2alpha. PGFR-mRNA was exclusively located in luteal cells, indicating that these cells are the only target for PGFalpha in the CL.

As was to be expected expression of the 3beta HSD in the CL was positively correlated with peripheral progesterone blood plasma concentrations. Strongest signals on the protein- and the mRNA-level were obtained at the beginning of the CL-phase. This was followed by decrease in the expression until the end of the observation period, matching the decrease of the progesterone concentrations. IHC and ISH exclusively located expression of 3beta HSD in the cytoplasm of the luteal cells.