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URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2007/4468/


Entdeckung und Charakterisierung einer neuen Genfamilie, SBFDCP7, bei Vertebraten und Bakterien

Godoy Bethet, José Rodrigo


Originalveröffentlichung: (2007) Giessen : VVB Laufersweiler 2007
pdf-Format: Dokument 1.pdf (3.324 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5122-8
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.01.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 02.03.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Die SBF-Proteindomäne (Sodium Bile acid symporter Family domain) kommt in zwei bereits
charakterisierten Proteinfamilien vor, SLC10 und ACR3. Die ersten charakterisierten Mitglieder der
SLC10-Familie sind die natriumabhängigen Gallensäuretransporter NTCP (SLC10A1) und ASBT
(SLC10A2). Beide Transporter sind essentiell an der Aufrechterhaltung des enterohepatischen
Kreislaufs der Gallensäuren beteiligt. In den letzten zwei Jahren wurden am Institut für
Pharmakologie und Toxikologie vier neue Mitglieder (SLC10A3 bis 6) dieser Proteinfamilie
identifiziert. Eines dieser Mitglieder, der SOAT (SLC10A6), transportiert keine Gallensäuren,
sondern sulfatierte Steroide. Damit wurde offensichtlich, dass nicht alle Mitglieder der SLC10-
Familie Gallensäurentransporter sind, was das bisherige Verständnis von der „Familie der
Gallensäuretransporter“ grundlegend veränderte. Mitglieder der ACR3-Familie wurden
ausschließlich in Hefen und Bakterien identifiziert und vermitteln einen Arsenit-resistenten
Phänotyp. In der vorliegenden Arbeit wird ein neues Protein, genannt P7, von Mensch, Ratte,
Maus und Frosch beschrieben. Diese Proteine wurden kloniert und charakterisiert. P7-Gene sind
in 12 Exonen organisiert und bilden zahlreiche Transkriptionsvarianten. Drei dieser Varianten
wurden in dieser Arbeit bei Mensch und Maus nachgewiesen und kloniert (P7 Variante 1 bis 3 bei
Mensch und Maus). Die Variante 1 und 3 von Maus und 1 von Mensch verändern nicht das
Leseraster, während Variante 2 und 3 von Mensch und 2 von Maus dies tun und zur Bildung
vorzeitiger Stop-Codons und dadurch C-Terminal-trunkierter Proteine führen. P7-Gen wird im
Körper sehr breit exprimiert, besonders stark in Herz, Gehirn, Leber, Milz, Dickdarm, Dünndarm
und Nebenniere. P7-Proteine bestehen aus 340-343 Aminosäuren und zeigen über 85 %
Sequenzidentität untereinander. Durch heterologe Expression in X. laevis-Oozyten wurden
radioaktiv markierte Gallensäuren (Taurocholat, Cholat und Chenodeoxycholat), Steroidsulfate
(Estron-3-sulfat, Dehydroepiandrosteronsulfat und Pregnenolonsulfat), Eicosanoide (Prostaglandin
E2 und Leukotriene C4), Digoxin und Estron-17ß-Glucuronid getestet. Allerdings konnte keine
Transportaktivität für die getesteten Substanzen nachgewiesen werden. Durch strategisch
eingebaute HA- und FLAG-Epitope und anschließende Immunfluoreszenz wurde für P7 eine
Membrantopologie von 10 Transmembrandomänen mit einem intrazellulär lokalisierten N- und CTerminus
bewiesen. P7 ist ein Protein von 27 kDa bei Mensch und Ratte und ist in der
Plasmamembran lokalisiert. Der N-Terminus von P7 wird proteolytisch nicht gespalten.

Weil P7 das 7. Säugetierprotein ist, welches die SBF-Domäne enthält, wurde es als SBFDCP7
„Sodium Bile acid Family Domain Containing Protein 7“ bezeichnet. Neben den Vertebraten-
Proteinen wurden zahlreiche SBFDCP7-verwandte Sequenzen von Bakterien, Pflanzen und
Hefen, die noch nicht charakterisiert worden sind, identifiziert. Die phylogenetische Verwandtschaft
der SBF-Familie wurde analysiert. Unter der SBF-Familie existieren drei gut definierte
Unterfamilien: ACR3, SBFDCP7 und SLC10. Zu den Mitgliedern der SLC10- und ACR3-Familie haben SBFDCP7 weniger als 15 % Sequenzidentität. Im Gegensatz dazu zeigen Vertebraten- und
Bakterien-SBFDCP7 eine höhere Sequenzidentität (> 20 %). Damit hat die SBFDCP7-Familie die
Besonderheit, im Gegensatz zu der SLC10- und ACR3-Familie, in allen drei Zweigen der belebten
Natur vorzukommen, nämlich in Pflanzen, Bakterien und tierischen Lebewesen. SBFDCP7-
Proteine zeigen eine vergleichbare Länge und Membrantopologie sowie zahlreiche konservierte
Proteindomänen von E. coli bis Mensch, was auf eine konservierte physiologische Funktion
hindeutet.
Mit dieser Arbeit sind die grundlegenden genomischen und biochemischen Erkenntnissen zu
dieser Proteinfamilie sowie die Expression von vier neuen Proteinen aufgeklärt worden. Ebenso
liegen in dieser Arbeit die ersten phylogenetischen Daten dieser neuen Proteinfamilie SBFDCP7
vor.
Kurzfassung auf Englisch: There are two well-characterized protein families, which contain the SBF protein domain (Sodium
Bile acid symporter Family domain): SLC10 and ACR3. NTCP (SLC10A1) and ASBT (SLC10A2)
are well-known sodium-dependent bile acid transporters. These carriers are essentially involved in
the maintenance of the enterohepatic circulation of bile acids. In addition to NTCP and ASBT, we
recently identified further members of the SLC10 family: SLC10A3 to A6. After the cloning of SOAT
(SLC10A6), which specifically transports steroid sulfates but not bile acids it became evident that
not all SLC10 members are bile acid transporters. The second SBF-family is referred to as ACR3
and is comprised of genes from bacteria and yeasts, which confer an arsenic-resistant phenotype.

In this Ph.D. thesis a new protein, named P7, from man, rat, mouse, and frog, was cloned and
characterized. P7 genes are organized in 12 exons and code numerous alternatively spliced
transcription variants. Three variants from man and mouse were here identified and cloned. Variant
1 and 3 from mouse and variant 1 from man do not alter the open reading frame, whereas variant 2
and 3 from man and 2 from mouse conduct to premature stop codons and thus to C-terminal
truncated protein isoforms. P7 genes are broadly expressed, among others, in heart, brain, liver,
spleen, colon, small intestine, and adrenal glands. P7 proteins consist of 340-343 amino acids and
have an overall sequence identity of > 85 %. P7 proteins were expressed heterologous in X. laevis
oocytes and uptake studies with radioactive labelled bile acids (taurocholate, cholate, and
chenodeoxycholate), steroid sulfates (estrone-3sulfate, dehydroepiandrosterone sulfate, and
pregnenolone sulfate), eicosanoids (prostaglandine E2 and leucotriene C4), digoxine, and estrone-
17ß-glucuronide, were conducted. However, no transport activity could be detected for these
compounds. With strategically inserted HA- and FLAG-epitopes and immunofluorescence
microscopy a membrane topology of 10 transmembrane domains was demonstrated strengthening
that both N- and C-terminus are intracellularly localized. P7 are membrane proteins of 27 kDa in
man and rat. The N-terminus is not splitted off by proteolysis. Because P7 represents the 7th
mammalian protein, which contains the SBF-domain, it was named SBFDCP7 Sodium Bile acid
Family Domain Containing Protein 7. Phylogenetic relationships of the SBF-Family were analyzed.

There are three well-defined SBF subfamilies among the SBF-family, e.i. ACR3, SBFDCP7, and
SLC10. Compared with SLC10 and ACR3 family members SBFDCP7 show < 15 % sequence
identity. By contrast, vertebrates and bacteria SBFDCP7 are more identical (> 20 % sequence
identity). In contrast to SLC10 and ACR3 families, members of the SBFDCP7 family exist within
the three branches of living organisms, namely in bacteria, plants, and animals. P7 proteins from
E. coli to man show a similar length and membrane topology as well as many conserved protein
domains. Therefore, a conserved physiological function of P7 is assumed. In this Ph.D. thesis the
underlying genomic and biochemical knowledge of four new SBF proteins were clarified. Also, the
first phylogenetical relationships of the new protein family SBFDCP7 are presented in this study.