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Untersuchungen zu leukozytären Oberflächenantigenen und der Bildung von IFN-gamma und IL-4 bei Zellen aus der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) von Pferden mit COB

Franz, Manuela


Originalveröffentlichung: (2006) Giessen : VVB Laufersweiler 2006
pdf-Format: Dokument 1.pdf (3.215 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Klinik für Pferde mit Lehrschmiede, Innere Medizin; Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 3-8359-5110-6
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.12.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 19.02.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Die Erkenntnisse zur Pathogenese der Chronisch Obstruktiven Bronchitis (COB) des Pferdes
sind lückenhaft, so dass bis zum heutigen Zeitpunkt lediglich eine symptomatische Therapie
zur Verfügung steht. Obwohl von mehreren Autoren vermutet wird, dass die Erkrankung wie
das Asthma des Menschen auf einer überschießenden TH2-Reaktion beruht, gelangten die
Untersucher, die ihren Studien hauptsächlich exazerbierte COB-Formen zugrunde legten,
bislang nicht zu einem einheitlichen Ergebnis.
Die Hypothese der vorliegenden Arbeit war, dass eine verbesserte phänotypische und
funktionelle Charakterisierung der Lymphozyten aus der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit
(BALF) bei klinischen COB-Patienten eine Detektion und Quantifizierung lymphozytärer
Veränderungen erlaubt, die Rückschlüsse auf die Pathogenese der Erkrankung zulassen.

In einem ersten Untersuchungsblock wurden 48 equine Patienten zunächst klinisch und
labordiagnostisch untersucht, tracheobronchoskopiert und einer bronchoalveolären Lavage
unterzogen. Die gewonnenen Zellen aus der BALF wurden lichtmikroskopisch differenziert.

Daneben erfolgte eine durchflusszytometrische Charakterisierung von Granulozyten,
Makrophagen und insbesondere Lymphozytensubpopulationen anhand von
Zweifachmarkierungen und der Detektion von Aktivierungsantigenen. Die
durchflusszytometrische Zelldifferenzierung wurde mit den lichtmikroskopischen
Differentialzellbildern verglichen. Zudem wurden über die Markierung mit
Detektionsantikörpern die beiden Zytokine IFN-gamma und IL-4 auf Niveau der Einzelzelle direkt
quantifiziert. Die durchflusszytometrischen Daten wurden auf Zusammenhänge mit den
Parametern aus der routinemäßigen COB-Diagnostik überprüft. Aus der Tiergruppe wurden
15 Pferde medikamentell mit Dexamethason, dem beta2-Sympathomimetikum Clenbuterol und
dem Mukolytikum Dembrexin behandelt. Weitere sieben Patienten wurden mit
Laserakupunktur therapiert. Diese Tiere erhielten keine Pharmaka und können als
Vergleichsprobanden dienen. Sieben Tage nach Beginn der jeweiligen Therapie wurden die
Patienten einem zweiten Untersuchungsblock unterzogen, so dass ein prä-/posttherapeutischer
Vergleich auf Ebene des Einzeltieres ermöglicht wurde.
Bei der an Blutzellen orientierten durchflusszytometrischen Identifikation der einzelnen
Abwehrzellpopulationen in der BALF wurde deutlich, dass sich in den eingestellten
Messregionen nicht ausschließlich die gewünschten Leukozyten befanden. Die
immunphänotypische Untersuchung ermöglichte die eindeutige Identifikation der
Lymphozyten, deren Nachweis auch in den Bereichen der Granulozyten und Makrophagen
gelang. In der Messregion der Lymphozyten trug im Vergleich mit CD4+ Zellen ein größerer
Prozentsatz der CD8+ Lymphozyten das CD9-Antigen, das auf aktivierten T-Zellen zu finden
ist. Zudem weisen insbesondere die Korrelationen mit der lichtmikroskopischen
Differenzierung darauf hin, dass Granulozyten aus der BALF sowohl das CD13- als auch das
CD9-Antigen tragen.
Im Zuge der posttherapeutischen Verbesserung der klinischen Krankheitssymptomatik
konnten in den Regionen von Lymphozyten und Makrophagen prozentuale Anstiege von
CD9+ Lymphozyten verzeichnet werden, die nicht mit den übrigen Lymphozytenmarkern
anzufärben waren, so dass diese aktivierten Zellen mit einem günstigen Einfluss auf die
Lungengesundheit der Patienten verknüpft sind.
Zur Beurteilung der Lymphozytenfunktion wurde erstmals eine direkte Quantifizierung der
IFN-gamma bzw. IL-4 produzierenden Zellen aus der BALF mit kreuzreagierenden bovinen
Detektionsantikörpern durchgeführt. Die prätherapeutischen Prozentsätze der IFN-gamma bzw. IL-4
bildenden Lymphozyten sprechen für ein TH2-geprägtes Zytokinmuster in den Atemwegen
der untersuchten COB-Patienten. Posttherapeutisch war bei den meisten Pferden ein Anstieg
des Anteils IFN-gamma+ Lymphozyten aus der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALL) zu
verzeichnen. Der Quotient der Prozentsätze IFN-gamma+ zu IL-4+ BALL stieg statistisch signifikant
an. Unterschiede zwischen den beiden Therapiemethoden konnten nicht ermittelt werden.

Sowohl in der Medikamenten- als auch in der Laserakupunkturgruppe wurde bei einem
Großteil der Probanden mit einer klinischen Verbesserung das Zytokinmuster in den tiefen
Atemwegen in Richtung eines TH1-Profils verändert.
Neben einer erweiterten und detaillierteren Untersuchung der Lymphozytensubpopulationen
ist somit insbesondere die funktionelle Charakterisierung der Lymphozyten aus der BALF
über die direkte Quantifizierung von IFN-gamma und IL-4 zur Aufdeckung lymphozytärer
Veränderungen bei klinischen COB-Patienten geeignet. Obwohl die Methodik des direkten
Zytokinnachweises für die Routinediagnostik bislang noch zu aufwendig erscheint, könnte sie
in zukünftigen Pathogenesestudien zur equinen COB bzw. für Entwicklung, Optimierung und
Vergleich neuer Therapieverfahren als wertvolles und objektivierbares Diagnostikum dienen.
Kurzfassung auf Englisch: Since knowledge of the pathogenesis of recurrent airway obstruction (RAO) in the horse is
incomplete, merely a symptomatic therapy is available. Many authors suspect, that the
disorder is comparable to human asthma and is based on an excessive TH2 reaction. However,
researchers, who mainly have investigated exacerbated forms of RAO, have not yet reached a
uniform conclusion.

The hypothesis of this dissertation was that an improved phenotypic and functional
characterization of lymphocytes in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) allows the
detection and quantification of lymphocytic changes in clinical RAO patients, allowing
conclusions to the pathogenesis of the disorder.
In the first examination block, 48 equine patients with RAO underwent clinical and laboratory
examinations, tracheobronchoscopy and bronchoalveolar lavage. BALF cells were
differentiated by light microscopy. In addition, a flow cytometric characterization of
granulocytes, macrophages and particularly lymphocyte subpopulations was performed by
immunofluorescent double staining and the detection of activation antigens. Results of flow
cytometric analysis were compared with cell differentiation by light microscopy.

Furthermore, via direct detection by antibodies, IFN-gamma and IL-4 were quantified on single-cell
level. All flow cytometric data were checked for correlations with the parameters of the
routine RAO diagnostics. From the total group of 48 animals, 15 horses were subsequently
medicated with Dexamethasone, the gamma2-sympathomimetic Clenbuterol and the mucolytic
Dembrexine. Additionally seven patients were treated with laser acupuncture. These animals
did not receive any pharmaceuticals and therefore serve to some degree as control subjects.
After seven days of therapy, the patients underwent a second examination block to enable a
pre/post-therapeutic comparison on a single-animal basis.
The blood cell oriented flow cytometric identification of BALF cell populations revealed, that
within the preset measuring gates, there were not exclusively expected leucocytes present.

The immunophenotypic analysis allowed a definite identification of lymphocytes, which were
to some degree detected in the granulocyte and macrophage gates. In the lymphocyte gate,
compared to the CD4+ cells, a higher percentage of CD8+ lymphocytes carried the CD9
antigen, which can be found on activated T-cells. Furthermore correlation coefficients
between flow cytometric and light microscopic cell differentiation indicate that granulocytes
in the equine BALF carry CD13 and CD9 antigens concurrently.

With post-therapeutic improvement of the clinical signs, increases of CD9+ lymphocytepercentages,
which could not be stained by the other lymphocyte markers, were recorded in
the lymphocyte and macrophage gates. This leads to the conclusion that these activated cells
have a positive effect on the patients lung health.
For the first time, as known to the author, lymphocyte function was assessed by direct
quantification of IFN-gamma and/or IL-4 producing BALF cells using cross-reacting bovine
detection antibodies. Percentages of IFN-gamma and/or IL-4 forming lymphocytes in BALF of
RAO patients were consistent with a TH2 cytokine pattern. After therapy, in most horses an
increase of the IFN-gamma+ bronchoalveolar lavage lymphocytes (BALL) was seen. Statistically,
the ratio IFN-gamma+/IL-4+ BALL percentages rose significantly. Differences between the two
therapy methods could not be detected. Medication and laser acupuncture caused in a majority
of subjects a significant clinical improvement and a change of the cytokine pattern in the deep
airways towards a TH1-profile.

In addition to an extended and more detailed examination of BALF lymphocyte
subpopulations, the direct quantification of IFN-gamma and IL-4 is especially helpful for the
assessment of functional changes in clinical RAO-patients. Direct cytokine detection so far is
too elaborate for routine diagnostic. However, in research towards pathogenesis and
improvement of therapy of equine RAO, it will serve as a valuable method.