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Evaluation of different approaches to enhancing arteriogenesis using isolated monocytes and GM-CSF treatment in an ischemic mouse hind limb model

Szymanski, Silvia


Originalveröffentlichung: (2006) Giessen : VVB Laufersweiler 2006
pdf-Format: Dokument 1.pdf (4.885 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Max-Planck-Institut für Herz- und Lungenforschung, W. G. Kerckhoff Institut
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 3-8359-5103-3
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.10.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 26.01.2007
Kurzfassung auf Englisch: Arteriogenesis, the growth of collateral arteries as a compensatory mechanism after
occlusion of a major artery, is a complex process in which peripheral blood cells have been
proposed to be involved. This study was concentrated on the role of monocytes, effects of
different monocyte concentrations in the blood and effects of monocyte pre-treatment with
specific substances on the enhancement of collateral artery growth.
For this purpose, a mouse ischemic hind limb model was established on the BALB/c
genetic background. After acute femoral artery occlusion, mice received intravenous
injections of monocytes in several concentrations, isolated from donor littermates using a cell
sorter. Moreover, we pre-treated monocytes with a synthetic prostaglandin (Cicaprost) or with
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). We also evaluated if treatment
of operated mice with GM-CSF alone could enhance collateral artery growth and if a
combination of monocyte injections with GM-CSF had a synergistic effect. Pedal blood flow
recovery in mice was measured using the laser Doppler imaging technique immediately after
operation and on postoperative day 3, 7, 14 and 21. Moreover, pedal hemoglobin oxygen
saturation was estimated at the same time points. Functional recovery of the foot movement
was observed during the whole trial period. On the day 21 after the operation, post-mortem
angiogramms were performed and adductor muscles were harvested for the morphometrical
analysis.

The hemodynamic data showed that injection of monocytes had a concentrationdependent
effect in enhancing of blood flow recovery in the operated foot. Seven days after
femoral artery ligature, the blood flow recovery (right-to-left ratio) was only 0.21 ± 0.02 in
control mice and significantly higher in mice which had obtained monocyte injections (0.30 ±
0.04 in mice with 2x105 monocytes injected, p<0.05 and 0.33 ± 0.04 in mice with 3x105
monocytes injected, p<0.01). Morphometrical analysis of adductor muscles of operated and
non-operated hind limbs showed that total collateral area ratio, which was obtained as a
parameter to estimate collateral artery size, increased markedly in monocyte-treated mice
compared to controls (2.37 ± 0.12 in mice with 2x105 monocytes injected; p<0.01 and 2.66 ±
0.12 in mice with 3x105 monocytes injected; p<0.01 vs. 1.88 ± 0.08 in controls). Pretreatment
of monocytes with Cicaprost or GM-CSF did not enhance their arteriogenic
properties. Administration of GM-CSF via intraperitoneal injections did not enhance the
blood flow recovery, however the combination of GM-CSF and monocyte injections had a moderate synergistic effect reflected in blood flow measurements (R/L ratio on day 7 was
0.40 ± 0.05 which was the highest ratio of all experimental groups of animals; p<0.01), as
well as in morphometrical analysis of adductor muscles (total collateral area ratio was 3.32 ±
0.14; p<0.01)
Our results show that monocytes/macrophages play a crucial role in enhancement of
collateral artery growth. In addition, a combination of GM-CSF treatment and monocyte
injections allows administration of smaller concentrations of therapeutics and results in a
superior blood flow recovery. Our study suggests a possibility of using cellular approaches for
the treatment of vascular occlusive diseases.
Kurzfassung auf Englisch: Als Arteriogenese wird das kompensatorische Wachstum von Kollateralgefäßen nach
arteriellen Verschlüssen bzw. chronischen Stenosen bezeichnet. Aufgrund von Ergebnissen frühere Studien vermutete man, dass an den komplexen Prozessen, die dieses Wachstum charakterisieren, zirkulierende Blutzellen, vor allem Leukozyten, beteiligt sind. Zielsetzung dieser Studie war es deshalb, die Rolle der Monozyten, die Effekte unterschiedlicher Blutmonozytenkonzentrationen und den Einfluss einer Vorbehandlung der Monozyten mit spezifischen Substanzen auf die Arteriogenese zu untersuchen.
Hiezu wurde das Hinterlauf-Ischämien-Modell in der Maus (BALB/c) verwendet.

Nach dem Verschluss der Arteria femoralis erhielten die Mäuse in unterschiedlichen
Konzentrationen intravenöse Injektionen von Monozyten, die zuvor aus genetisch identischen
Mäusen mittels cell sorter isoliert wurden. Weitere Versuchsgruppen wurden mit Monozyten
behandelt, die zuvor mit einem synthetischen Prostaglandinen (Cicaprost) bzw. mit dem
Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) vorbehandelt wurden.

Es wurde ebenfalls untersucht, ob Injektionen von GM-CSF das Kollateralgefäßwachstum
nach Okklusion der Femoralarterie verstärken und ob eine Kombinationstherapie aus GMCSF-
Injektionen und Monozytentransplantationen einen zusätzlichen stimulativen Effekt
haben. Sofort nach der Operation als auch an den Tagen 3, 7, 14 und 21 wurden Laserdoppler-
Untersuchungen zur Bestimmung der Wiederherstellung der pedalen Durchblutung
durchgeführt. Zusätzlich wurde die Sauerstoff-Sättigung im Hämoglobin in den distalen
Gefäßen bestimmt. Als funktioneller Parameter während des Beobachtungszeitraumes wurde
die aktive Bewegung der Hinterläufe quantifiziert. Drei Wochen nach Versuchsbeginn wurde
das Kollateralgefäßsystem durch Angiographien post mortem dargestellt und Gewebeproben
zur morphometrischen Analyse konserviert.

Die hämodynamischen Daten zeigen, dass die Monozyteninjektionen einen
dosisabhängigen positiven Effekt auf das Kollateralgefäßwachstum hatten. Am siebten Tag
nach dem Verschluss der Arteria femoralis war der pedale Blutfluss (rechts-zu-links Rate) in
Kontrollmäusen nur 0,21 ± 0,02 und signifikant höher in Mäusen, die Monozyten injiziert
bekommen haben (0,30 ± 0,04 in Mäusen, die 2x105 Monozyten bekommen haben; p<0,05
und 0,33 ± 0,04 in Mäusen, die 3x105 Monozyten bekommen haben; p<0,01).

Morphometrische Analysen der Adduktoren von den operierten und nicht operierten
Hinterläufen ergaben, dass die gesamte Kollateralflächenrate, die als Parameter zur
Bewertung der Kollateralgefäßgröße diente, war in Monozyten behandelten Mäusen verglichen mit den Kontrollen deutlich erhöht (2,37 ± 0,12 in Mäusen, die 2x105 Monozyten
bekommen haben; p<0,01 und 2,66 ± 0,12 in Mäusen, die 3x105 Monozyten bekommen
haben; p<0,01 vs. 1,88 ± 0,08 in Kontrollen). In Gegensatz hierzu hatten die
Vorbehandlungen der Monozyten mit Cicaprost oder GM-CSF keinen weiteren arteriogenen
Effekt. Des weiteren verstärkten die Injektionen von GM-CSF die Wiederherstellung der
Durchblutung nicht, auch wenn die Kombinationstherapie von GM-CSF und Monozyten-
Injektionen einen moderaten synergistischen Effekt hatte (R/L Rate am Tag 7 war 0,40 ±
0,05, der höchste Wert von allen Versuchsgruppen; p<0,01). Diese Ergebnisse wurden durch
histologische Untersuchungen der Adduktorenmuskulatur von operierten und nicht operierten
Hinterläufen erhärtet (die gesamte Kollateralflächenrate war 3,32 ± 0,14; p<0,01).

Die Ergebnisse zeigen, dass die Monozyten/Makrophagen eine wichtige Rolle in der
Stimulierung des Kollateralgefäßwachstums spielen. Außerdem ist es möglich durch die
Kombination von GM-CSF- mit Monozyten-Injektionen die Konzentrationen der
Therapeutika gegenüber der Einzeldosierungen zu reduzieren, wobei trotzdem die besten
Ergebnisse erzielt werden konnten. In dieser Studie wurden die Grundlagen zum Einsatz
zellulärer Therapeutika in der Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen geschaffen.