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Regulation der Cbfa1 Expression in humanen gesunden und arthrotischen Gelenkchondrozyten in vitro

Nusselt, Thomas


pdf-Format: Dokument 1.pdf (671 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Knorpel , cbfa1 , Alginat , 3D Matrix
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Pathologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 15.01.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Einer der frühesten Marker und grundlegende Voraussetzung für eine osteoblastäre Zelldifferenzierung ist der Core binding factor alpha1 (Cbfa1). Studien mit knock-out Mäusen konnten ebenfalls eine Rolle des Cbfa1 auf die Reifung von Chondrozyten und für die enchondrale Ossifikation zeigen. Dies lässt auf ein Differenzierungspotential von kartilaginären Zellen in osteoblastäre Zellen schließen. In dieser Studie wurde die Expression und Regulation von Cbfa1 in gesunden und arthrotischen humanen Gelenkchondrozyten in vitro in Abhängigkeit von Kulturdauer und dem Einfluss einer dreidimensionalen Zellanordnung in einer Alginatmatrix untersucht.

Die humanen Gelenkchondrozyten wurden aus Operationspräparaten isoliert. Die so gewonnenen Chondrozyten wurden mit DMEM/Hams F12K Medium, 20% fetalem Kälberserum und 1% Penicillin/Streptomycin in einer Atmosphäre von 5% CO2 bei 37°C kultiviert. Es wurden zweidimensionale und auf Alginat basierende dreidimensionale Kulturen angelegt. Aus diesen Ansätzen wurde in regelmäßigen Abständen die Expression des Cbfa1 mittels mRNA Extraktion und Amplifikation (PCR) untersucht. Die Bestimmung wurde nach Standardprotokollen (Qiagen) durchgeführt, eine quantitative Bestimmung erfolgte im Verhältnis zum Housekeeping Gen HPRT.
Bei unseren Untersuchungen konnte in arthrotischen humanen Chondrozytenkulturen, im Vergleich zu gesunden, eine unterschiedliche Cbfa1 Expression beobachtet werden. Bei den arthrotischen kam es anfänglich zu einem signifikanten Anstieg der Genexpression, der im Verlauf der Beobachtungen, der in Alginat eingebrachte Zellen, rückläufig wurde, bis die Cbfa1 Expression schließlich wieder dem Anfangsniveau entsprach.
Die gesunden humanen Chondrozyten zeigten nur minimale Veränderung an. Die Werte für die Genexpression bewegten sich während der gesamten Untersuchung um die gemessene Anfangsexpression.

Die in dieser Studie beobachtete Regulation des Core binding factor alpha1 (Cbfa1), könnte eine Erklärung des Krankheitsverlaufs bei degenerativen Arthrosen bieten. Die Umdifferenzierung (Plastizität) der Chondrozyten in Richtung eines mehr osteoblastären Phänotyps kann möglicherweise die mangelnde Regeneration arthrotischen Knorpels erklären. Andererseits eröffnet die Redifferenzierung in der auf Alginat basierenden dreidimensionalen Chondrozytenkultur eine Möglichkeit der Erzeugung differenzierter Knorpelzelltransplantate auch aus bereits arthrotisch vorgeschädigtem Gewebe.

Die hier vorgestellten Ergebnisse bieten zum einen auf molekularer Ebene, eine mögliche Erklärung für die Pathologie der Arthrose, eröffnen aber auch zum anderen Optionen für mögliche Strategien zur Behebung bereits entstandener Schäden im Bereich des Gelenkknorpels.
Kurzfassung auf Englisch: One of the earliest markers and basic condition for an osteoblast cell differentiation is the core binding factor and alpha 1 (cbfa1). Studies with knock-out mice could show a role of cbfa1 at the maturation of chondrocytes and for enchondral ossification. This allows closing on a differentiation potential of cartilage cells into osteoblast cells. In this study the expression and regularization was examined by cbfa1 in healthy and arthrotic human articular chondrocytes in vitro as a function of cultural duration and the influence of a three-dimensional cell arrangement in an alginate matrix.

The human articular chondrocytes were isolated from operation preparations. The won chondrocytes were cultivated with DMEM/Hams F12K medium, 20% fetal calf serum and 1% of penicillin/streptomycin in an atmosphere of 5% CO2 with 37°C. It was put on two-dimensional and on alginate based three-dimensional cultures. From these attempts the expression of cbfa1 was examined at regular intervals by mRNA extraction and amplification (PCR). The regulation was determined to standard protocols (Qiagen), a quantitative regulation occurred in proportion to housekeeping gene HPRT.
With our analysis a different cbfa1 expression could be observed in arthrotic human articular chondrocytes in comparison to healthy ones. The arthrotic chondrocytes came at first to a significant increase of the genetic expression which became falling in the course of the observations, concerning the cells cultured in alginate, until the cbfa1 expression, in the end, again corresponded to the beginning level.
The healthy human chondrocytes indicated only minimum change. The values of the genetic expression moved during the whole investigation around the measured beginning expression.

The regularization observed in this study of the core binding factor alpha 1 (cbfa1), could offer an explanation of the illness course by osteoarthritis. The dedifferentiation (plasticity) of the chondrocytes in the direction of more osteoblastic phenotype can possibly explain the lacking regeneration of arthrotic cartilage. On the other hand, the redifferentiation opens a possibility for the production of differentiated cartilage cell grafts also from already arthrotic preinjured chondrocytes in the three-dimensional culture basing on alginate.
The presented results offer, on the one hand, at molecular level, a possible explanation of the pathology of the osteoarthritis, however, open also for the other option possible strategies to the removal already in this area damaged joint cartilage.